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May 18, 2023

Gehirn

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 7740 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

In dieser Studie geht es um die Quantifizierung und Validierung der BDNF-Spiegel im Mausserum und -plasma mithilfe eines empfindlichen Immunoassays. Während BDNF-Spiegel im menschlichen Serum leicht nachweisbar sind, sind die funktionellen Auswirkungen dieser Messungen unklar, da aus menschlichen Blutplättchen freigesetztes BDNF den Hauptbeitrag zu den BDNF-Serumspiegeln leistet. Da Blutplättchen von Mäusen kein BDNF enthalten, fehlt dieser Störfaktor bei der Maus. Dementsprechend wurde festgestellt, dass die BDNF-Spiegel im Mausserum und -plasma mit 9,92 ± 1,97 pg/ml für Serum und 10,58 ± 2,43 pg/ml für Plasma nicht unterscheidbar waren (p = 0,473). Diese Werte sind etwa tausendmal niedriger als die im menschlichen Serum gemessenen Werte, und die Voradsorption mit Anti-BDNF, jedoch nicht mit monoklonalen Anti-NGF- oder Anti-NT3-Antikörpern, reduzierte das BDNF-Signal deutlich. Diese Ergebnisse eröffnen die Möglichkeit, die Relevanz von BDNF-Spiegeln als Biomarker in zugänglichen Körperflüssigkeiten mithilfe bestehender Mausmodelle zu untersuchen, die menschliche pathologische Zustände nachahmen.

Die Diagnose neurodegenerativer Erkrankungen und die Überwachung therapeutischer Interventionen würden von der Entwicklung und Validierung relevanter Biomarker stark profitieren. Angesichts der vielfältigen Rollen des aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktors (BDNF) wäre es wünschenswert, über zuverlässige und effiziente Methoden zur Messung der BDNF-Spiegel in geeigneten Tiermodellen und relevanten Körperflüssigkeiten zu verfügen. Obwohl mehrere BDNF-Enzym-Immunoassays (ELISAs) verfügbar sind, ermöglichen sie nur Messungen in Geweben, in denen der BDNF-Gehalt vergleichsweise hoch ist, beispielsweise in Gehirnextrakten oder menschlichem Serum. Im Gegensatz dazu reicht die Empfindlichkeit dieser ELISAs nicht aus, um die BDNF-Spiegel im Mäuseserum zu messen1,2,3,4. Da die Maus das am häufigsten verwendete Tiermodell ist, um die Relevanz von Biomarkern und mögliche Korrelationen mit Zuständen zu testen, die menschliche Krankheiten widerspiegeln, haben wir uns vorgenommen, die BDNF-Spiegel in Blutproben von Mäusen mithilfe eines kommerziell erhältlichen, hochempfindlichen ELISA zu messen. Bei Mäusen wird das Bdnf-Gen im Gegensatz zum Menschen nicht in nennenswerten Mengen in Megakaryozyten3 exprimiert, der Quelle von BDNF, die in menschlichen Blutplättchen gespeichert ist und bei der Blutplättchenaktivierung und -degranulation während des Blutgerinnungsprozesses freigesetzt wird. Dennoch deuten neuere Ergebnisse darauf hin, dass BDNF im Blut von Mäusen vorhanden ist und aus anderen Quellen als Blutplättchen stammt, einschließlich der Skelettmuskulatur4. Darüber hinaus wurde in derselben Studie gezeigt, dass der BDNF im Blut von Mäusen von physiologischer Relevanz ist und den verkürzten BDNF-Rezeptor TrkB mit der Bezeichnung TrkB.T1 aktivieren kann, der von Pankreas-β-Zellen exprimiert wird4. Da der TrkB.T1-Rezeptor weit außerhalb des Nervensystems exprimiert wird, ist es wahrscheinlich, dass aus dem Blut stammendes BDNF auf Gewebe jenseits der endokrinen Bauchspeicheldrüse abzielt. Das Ausmaß, in dem Schwankungen der BDNF-Spiegel im Blut von Mäusen mit Erkrankungen korrelieren, die die Funktion des Nervensystems beeinträchtigen, bleibt unklar, da es bisher nicht möglich war, die BDNF-Spiegel im Blut von Mäusen zu quantifizieren.

Wir berichten über die Charakterisierung und Validierung eines BDNF-ELISA, der die Messung des BDNF-Spiegels im Blut von Mäusen ermöglicht. Diese Werte waren drei Größenordnungen niedriger als die bei Primaten5 und stehen im Einklang mit dem Fehlen einer nachweisbaren Bdnf-Genexpression in Maus-Megakaryozyten; Es wurden keine Unterschiede in den BDNF-Spiegeln zwischen Mäuseserum und -plasma festgestellt.

Blutproben wurden von erwachsenen männlichen und weiblichen Mäusen entnommen und die BDNF-Spiegel gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt (siehe Abschnitt „Methoden“). Die mittleren BDNF-Konzentrationen im Serum lagen im niedrigen pg/ml-Bereich und unterschieden sich nicht signifikant zwischen Männern und Frauen, mit p = 0,126, ungepaarter t-Test (siehe Abb. 1a,b). Während die berichteten Serumspiegel von BDNF beim Menschen erheblich variieren (siehe zum Beispiel Polacchini et al. 20156 und Naegelin et al. 20187 und die darin enthaltenen Referenzen), sind sie beim Menschen etwa tausendmal höher, was auf die Freisetzung von Blutplättchen bei der Blutgerinnung zurückzuführen ist . Das Fehlen einer signifikanten Expression des Bdnf-Gens in Maus-Megakaryozyten und der damit verbundene Mangel an BDNF in Western-Blot-Experimenten mit Thrombozytenlysaten von Mäusen3 veranlassten uns, die BDNF-Spiegel im Plasma sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Tieren mit demselben BDNF-ELISA zu messen für Serum (Abb. 2a,b). Von weiteren 12 Mäusen (6 Männer, 6 Frauen, alle 8 Wochen alt) wurden Serumproben und von weiteren 12 Mäusen (6 Männer, 6 Frauen, alle 8 Wochen alt) Plasmaproben entnommen. Die mittleren BDNF-Konzentrationen unterschieden sich nicht signifikant: 9,92 ± 1,97 pg/ml für Serum und 10,58 ± 2,43 pg/ml für Plasma (p = 0,473, ungepaarter t-Test). Es wurde weder im Serum noch im Plasma ein Unterschied zwischen Männern und Frauen festgestellt: männliches Serum 10,31 ± 1,64 pg/ml, weibliches Serum 9,53 ± 2,34 pg/ml (p = 0,512), männliches Plasma 10,58 ± 3,01, weibliches Plasma 10,57 ± 1,98 pg/ml. ml (p = 0,999, ungepaarter t-Test). Die Daten bestätigen, dass Blutplättchen bei Mäusen nicht die Quelle von BDNF im Blut sind, im Gegensatz zu Menschen, wo sie ein größeres Reservoir enthalten (siehe oben), was dazu führt, dass die Serumkonzentrationen von BDNF beim Menschen etwa zehnmal höher sind als im Plasma7,8.

BDNF-ELISA-Ergebnisse von Mäuseserumproben unter Verwendung des ausgereiften BDNF-ELISA-Kits Wako, High Sensitive (Fujifilm, Wako Nr. 298–83,901). (a) BDNF-Konzentration in pg/ml von Serumproben von C57BL6/J-Mäusen. Punkte zeigen die Konzentrationen für jedes Triplikat, die Spalte zeigt den Mittelwert der drei Triplikate für Proben von jedem einzelnen, Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung der drei Triplikate. (b) Mittlere Serum-BDNF-Konzentration männlicher und weiblicher C57BL6/J-Mäuse, p = 0,128, ungepaarter t-Test. Punkte geben die Konzentration für einzelne Tiere an (Mittelwert der Dreifachbestimmungen), die Spalte gibt den Gruppenmittelwert an, Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung.

BDNF-ELISA-Ergebnisse von Mäuseserum- und -plasmaproben. (a) BDNF-Konzentration in pg/ml von Serum- und Plasmaproben von C57BL6/J-Mäusen. Punkte zeigen die Konzentrationen für jedes Triplikat, die Spalte zeigt den Mittelwert der drei Triplikate für Proben von jedem einzelnen, Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung der drei Triplikate. (b) Mittlere Konzentration von Serum- und Plasmaproben. Punkte geben die Konzentration für einzelne Tiere an (Mittelwert der Dreifachbestimmungen), die Spalte gibt den Gruppenmittelwert an, Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung, p = 0,473, ungepaarter t-Test.

Während die BDNF-ELISA-Werte in Mäuseserum und -plasma deutlich über dem Hintergrund liegen, sind sie tatsächlich sehr niedrig und eine wahrscheinliche Erklärung für frühere Fehler beim Nachweis von BDNF in Mäuseserumproben. Die geringe Intensität des Lumineszenz-ELISA-Signals wirft jedoch die Frage auf, ob dieses Signal tatsächlich das Vorhandensein von BDNF im Mausserum oder -plasma widerspiegelt. Um diesen kritischen Punkt zu klären, wurde ein monoklonaler BDNF-Antikörper mit der Bezeichnung AB#9, der in früheren Studien ausführlich charakterisiert wurde9,10, festphasengebunden an Bead-gekoppeltes Protein G gebunden und verwendet, um zu testen, ob dieser Antikörper das BDNF-Signal verringern würde nach einer 3-stündigen Inkubation von Mäuseserumproben. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass dies tatsächlich der Fall war, da in Kontrollserumproben, die nur mit Protein-G-Kügelchen inkubiert wurden, keine Signalverringerung beobachtet wurde (Abb. 3a, b). Da BDNF zur kleinen Familie der Neurotrophine gehört, zu der auch der Nervenwachstumsfaktor (NGF) und Neurotrophin-3 (NT3) gehören, haben wir auch überprüft, dass die Verringerung des BDNF-Signals spezifisch für die BDNF-Bindung ist. Mit monoklonalen Anti-NGF11- oder Anti-NT3-Antikörpern12 beschichtete Protein-G-Kügelchen wurden dann mit Mäuseserumproben inkubiert und die BDNF-Spiegel in den Überständen gemessen. Im Gegensatz zu den Ergebnissen, die mit dem monoklonalen BDNF-Antikörper AB#9 erzielt wurden, wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet, wenn der Serumüberstand vor und nach der Adsorption mit Anti-NGF- oder Anti-NT3-Antikörpern untersucht wurde (Abb. 3a, b). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass das durch den in der vorliegenden Studie verwendeten BDNF-ELISA nachgewiesene Signal speziell das Vorhandensein von BDNF im Mausserum und nicht von NGF oder NT3 widerspiegelt, obwohl diese drei Proteine ​​eng verwandte Homodimere bilden, was durch ihre ähnliche Bindung veranschaulicht wird Affinitäten für den Neurotrophinrezeptor p7513.

BDNF-ELISA-Ergebnisse einer gepoolten Serumprobe nach Inkubation mit Antikörpern gegen verschiedene Neurotrophine. (a) BDNF-Konzentration einer gepoolten Serumprobe nach Inkubation mit Protein-G-Perlen allein (Kontrolle), Anti-NT3-beschichteten Protein-G-Perlen, Anti-NGF-beschichteten Protein-G-Perlen und Anti-BDNF-beschichteten Protein-G-Perlen. Punkte zeigen die Konzentrationen für jedes Triplikat, die Spalte zeigt den Mittelwert der drei Triplikate für Proben von jedem einzelnen, Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung der drei Triplikate. (b) Mittlere Serum-BDNF-Konzentration nach Inkubation mit Protein-G-Perlen allein (Kontrolle), Anti-NT3-beschichteten Protein-G-Perlen, Anti-NGF-beschichteten Protein-G-Perlen und Anti-BDNF-beschichteten Protein-G-Perlen. Punkte geben die Konzentration für die einzelne Probe an (Mittelwert der Dreifachproben), die Spalte gibt den Gruppenmittelwert an, Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung, p = 0,0001 einfache ANOVA.

Das Hauptergebnis dieser Studie ist, dass die BDNF-Spiegel im Blut von Mäusen mit einem kommerziell erhältlichen ELISA, der mit BDNF-spezifischen Antikörpern validiert wurde, leicht quantifiziert werden können. Angesichts früherer Fehler bei der Quantifizierung der BDNF-Spiegel im Mäuseserum durch ELISAs1,3 sind diese Werte erwartungsgemäß im Vergleich zu den im menschlichen Serum bestimmten BDNF-Spiegeln bemerkenswert niedrig (siehe Einleitung). Dieser Artenunterschied kann leicht durch das Fehlen nachweisbarer BDNF-Werte in Blutplättchen von Mäusen erklärt werden, anders als bei menschlichen Blutplättchen3. Die Ähnlichkeit zwischen den BDNF-Konzentrationen in Serum und Plasma zeigt weiter, dass der im Mäuseserum nachgewiesene BDNF im Gegensatz zu menschlichen Proben nicht aus Blutplättchen stammt. Tatsächlich beinhaltet die Plasmagewinnung aus frischem Blut im Gegensatz zu Serum die Zugabe von EDTA zum Zeitpunkt der Blutentnahme, was die Aktivierung und Degranulation der Blutplättchen verhindert (siehe Abb. 4 und Abschnitt „Methoden“). Das Vorhandensein von BDNF im Plasma von Mäusen, jedoch keine Quantifizierung, wurde in einer kürzlich durchgeführten Western-Blot-Studie unter Verwendung eines BDNF-Anreicherungsverfahrens mit festphasengebundenen TrkB-Reagenzien berichtet4. Dieselbe Studie ergab auch, dass eine Hauptquelle für BDNF im Blut der Maus möglicherweise die Skelettmuskulatur ist.

Die BDNF-Spiegel im Mausserum und -plasma bleiben nach der Aktivierung/Degranulierung der Blutplättchen unverändert, da sie aus Quellen wie der Skelettmuskulatur stammen. Durch die Zugabe von EDTA bleiben Blutplättchen in einem Plasmapräparat im Ruhezustand. Für den Menschen bedeutet dies, dass das große BDNF-Reservoir in Blutplättchen innerhalb der Blutplättchenkörnchen verbleibt (a). Die Serumzubereitung bewirkt eine Aktivierung und Degranulation der Blutplättchen, was zu einer viel höheren nachweisbaren BDNF-Konzentration im Serum führt (b). Mäuse exprimieren BDNF nicht in Megakaryozyten/Blutplättchen und die Konzentration von BDNF wurde daher durch die Blutplättchenaktivierung nicht beeinflusst. Die Ähnlichkeit zwischen den Konzentrationen im Plasma (c) und im Serum (d) lässt darauf schließen, dass die geringe Menge an BDNF aus einer Quelle stammt, die nicht aus Blutplättchen besteht. Erstellt mit Biorender.com.

Wir stellen fest, dass einige Mausproben eine größere Streuung der dreifachen Messungen als erwartet aufwiesen (siehe Abb. 1a, Proben M4, M5, M9), was darauf hindeutet, dass die Positionen der Proben in der 96-Well-Platte möglicherweise zu dieser Variabilität beigetragen haben eine Probe in einer Eckvertiefung und zwei weitere neben einer Probe mit viel höherer Lumineszenz. Obwohl die 96-Well-Platte undurchsichtig ist, könnte ein Lumineszenzüberschuss aus benachbarten Wells zu einem Teil der beobachteten dreifachen Variabilität beitragen. In der Praxis könnte dieses Problem gemildert werden, indem vermieden wird, Proben, von denen erwartet wird, dass sie niedrige Lumineszenzwerte aufweisen, neben Proben mit hohen Werten der BDNF-Standardkurve zu platzieren.

Das hier verwendete BDNF-ELISA-Kit ist nicht nur hochempfindlich, sondern auch spezifisch für BDNF, da die Adsorption von Mäuseserumproben mit dem monoklonalen BDNF-Antikörper AB#9 das BDNF-ELISA-Signal deutlich verringert (Abb. 3b). Dieser Rückgang wurde nicht beobachtet, wenn AB#9 durch monoklonale Antikörper gegen NGF oder NT3 ersetzt wurde (Abb. 3a). Im Hinblick auf die Zielspezifität ist zu beachten, dass AB#9 gegen das native BDNF-Protein9 gezüchtet wurde, wohingegen der im ELISA-Kit als Fängerantikörper verwendete monoklonale Anti-BDNF-Antikörper gegen ein Peptid gezüchtet wurde, das dem Aminoterminal von reifem BDNF entspricht. Es ist daher unwahrscheinlich, dass die beiden in dieser Studie verwendeten monoklonalen BDNF-Antikörper identische Epitope erkennen. Darüber hinaus führt die Serumvorbereitung zur Freisetzung einer großen Menge und Vielfalt von Wachstumsfaktoren und Zytokinen aus Blutplättchen, beispielsweise dem aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktor (PDGF) und TGF-β114,15. Es ist daher bemerkenswert, dass kein Unterschied in den BDNF-Konzentrationen zwischen den Plasma- und Serumproben der Maus festgestellt wurde, was die Spezifität des in der Studie verwendeten ELISA-Kits weiter unterstreicht.

Die Verfügbarkeit einer robusten Methode zur Quantifizierung von BDNF im Mausserum, selbst bei sehr geringen Konzentrationen, eröffnet die Möglichkeit, nun die Rolle von BDNF in Stoffwechselprozessen zu untersuchen, einschließlich seiner Rolle bei der Regulierung des Blutzuckerspiegels in relevanten Mausmodellen. Wie von Fulgenzi et al. (2020)4 ist es wahrscheinlich, dass körperliche Bewegung den BDNF-Spiegel im Blut sowie in der Skelettmuskulatur erhöhen kann. Im Gegensatz dazu leidet die Interpretation der Messungen der BDNF-Spiegel im Serum beim Menschen unter dem Beitrag von Blutplättchen-BDNF, der relevante funktionelle Beiträge anderer Gewebe verschleiern könnte. Während Plasmakonzentrationen von BDNF beim Menschen gemessen wurden, sind die Ergebnisse sehr unterschiedlich und spiegeln wahrscheinlich den Grad der Thrombozytenaktivierung während des Blutentnahmeprozesses wider. Der BDNF-Gehalt in menschlichen Blutplättchen ist so hoch, dass die Aktivierung selbst eines kleinen Teils der Blutplättchen ausreichen würde, um die im Plasma gemessene BDNF-Konzentration deutlich zu beeinflussen. Zur Bestimmung des BDNF-Spiegels im menschlichen Plasma wären zusätzliche Messungen von Blutplättchenaktivierungsmarkern wie dem Blutplättchenfaktor 4 (PF4) erforderlich, der mit BDNF in ∝-Granula kolokalisiert, um den Grad der Aktivierung zu bestimmen.

Die hier beschriebenen Eigenschaften des BDNF-ELISA ermöglichen nun die Quantifizierung der BDNF-Spiegel in geeigneten Körperflüssigkeiten von Mäusen. Dies eröffnet die Möglichkeit, dass Mausmodelle, die Erkrankungen beim Menschen nachahmen, einschließlich Depressionen16, Alzheimer-Krankheit17, Autismus oder Schizophrenie18, ausgewertet werden könnten, um festzustellen, ob die BDNF-Spiegel im Mausserum, -plasma, in der Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit (CSF) oder im Kammerwasser mit funktionellen Phänotypen korrelieren.

An lebenden Tieren wurden keine Eingriffe durchgeführt, die Blutentnahme erfolgte postmortal. Mäusestudien wurden von der Tierschutz- und Ethikprüfungsstelle der Universität Cardiff genehmigt und alle Experimente wurden gemäß den Richtlinien des Home Office Animals (Scientific Procedures) Act von 1986 und den Vorschriften und Richtlinien der Institution (Universität Cardiff) durchgeführt. Methoden und Ergebnisse wurden gemäß den ARRIVE-Richtlinien gemeldet. Vor der Probenentnahme wurden die Mäuse in M3-Käfigen (48 × 15 × 13 cm, 510 cm2 Grundfläche) mit 1–5 erwachsenen Mäusen pro Käfig bei einer kontrollierten Raumtemperatur von 20–24 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 55 % gehalten. ± 10 %. Sie wurden in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten und hatten Zugang zu Nahrung nach Belieben.

C57BL/6 J-Mäuse (Charles River) wurden mit CO2 getötet und unmittelbar nach dem Tod durch Herzpunktion Blut gesammelt und entweder zu Plasma oder Serum verarbeitet. Von jeder Maus wurden etwa 800–1000 µL Vollblut gesammelt.

Blutproben wurden in ein Eppendorf-Röhrchen überführt und 1 Stunde bei Raumtemperatur und anschließend 1 Stunde bei 4 °C ruhen gelassen. Die Proben wurden dann 10 Minuten lang bei 2000 G und 4 ° C zentrifugiert. Das Serum wurde gesammelt (von der Oberseite des Röhrchens) und erneut 10 Minuten lang bei 2000 G und 4 °C zentrifugiert, um alle verbleibenden Zellen zu entfernen. Anschließend wurden die Serumproben bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert.

Das Blut wurde in einer Spritze mit 20 µl 500 mM EDTA gesammelt und vorsichtig gut gemischt. Anschließend wurden die Proben 10 Minuten lang bei 2000 G und 4 °C zentrifugiert. Die oberen 2/3 des Plasmas wurden dann vorsichtig entfernt und in ein neues Röhrchen überführt, bevor sie zur weiteren Reinigung erneut 10 Minuten lang bei 2000 G und 4 °C zentrifugiert wurden. Dieses Plasma wurde dann gesammelt, wobei darauf geachtet wurde, dass keine verbleibenden Rückstände am Boden des Röhrchens aufgewirbelt wurden, und zur Lagerung bei –80 °C bis zur Verwendung aliquotiert.

Die Quantifizierung der BDNF-Konzentration in Serum und Plasma wurde mit dem Mature BDNF ELISA Kit Wako, High Sensitive (Fujifilm, Wako #298–83,901) gemäß den Anweisungen des Herstellers und unter Verwendung der im ELISA-Kit enthaltenen Reagenzien durchgeführt. Kurz gesagt, die Proben wurden mit der Kit-Pufferlösung vierfach verdünnt und der BDNF-Standard unter Verwendung der bereitgestellten Reagenzien hergestellt, um eine Stammlösung von 10 ng/ml zu erzeugen. Diese Stammlösung wurde dann mit dem bereitgestellten Puffer gemischt, um eine Reihe von Standardlösungen gemäß den Anweisungen des Kits zu erzeugen. Anschließend wurde die zunächst die ELISA-Platte füllende Lösung verworfen und die Vertiefungen viermal mit der im Kit enthaltenen Waschlösung (1X) gewaschen. Die Platte wurde nach jedem Waschen umgedreht und gegen saubere Papiertücher abgetupft, um überschüssige Flüssigkeit, die in den Vertiefungen verblieben war, zu entfernen. 50 µL der verdünnten Standardlösung und der verdünnten Proben wurden in die jeweiligen Vertiefungen gegeben, wobei für jeden Standard und jede Probe drei Vertiefungen verwendet wurden. Anschließend wurde die Platte abgedeckt und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur (20–25 °C) auf einem Mikrotiterplattenschüttler geschüttelt. Nach einer 2-stündigen Inkubation wurde die Lösung verworfen und die Vertiefungen erneut viermal mit Waschlösung wie oben gewaschen. In jede Vertiefung wurden 50 µl Biotin-konjugierte Antikörperlösung gegeben, die Platte abgedeckt und erneut 1 Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert. Die Lösung wurde dann verworfen und die Vertiefungen wurden viermal mit Waschpuffer wie oben gewaschen. In jede Vertiefung wurden 50 µl Peroxidase-konjugierte Streptavidin-Lösung gegeben, die Platte abgedeckt und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert. Nach einer letzten Serie von 4 Waschgängen mit dem Waschpuffer wurden 50 µL der gemischten Lumineszenzreagenzien 1 und 2 (1:1) in jede Vertiefung gegeben, die Platte 1 Minute lang auf einen Schüttler gestellt und die Lumineszenz dann mit einem 96-60°C gemessen. Well-Mikroplatten-Reader (FLUOstar Omega, BMG Labtech). Die Messung erfolgte 10 Minuten nach Zugabe des Lumineszenzreagenzes. Die Standardlösungen wurden verwendet, um eine Standardkurve zu erstellen, die die Lumineszenz in BDNF-Konzentrationen umwandelt und zur Bestimmung der BDNF-Konzentration in den Versuchsproben verwendet wird.

60 µL Sepharose-Protein-G-Kügelchen wurden gewaschen und in PBS resuspendiert. Anschließend wurden sie mit 30 µg monoklonalen Anti-BDNF- (Ab#9), Anti-NGF- oder Anti-NT3-Antikörpern (Referenzen siehe Abschnitt „Ergebnisse“) oder PBS allein 1 Stunde lang auf Eis unter intermittierendem Vortexen inkubiert. Die Perlen wurden dann 30 Sekunden lang bei 12.000 G zentrifugiert, danach wurde der Überstand verworfen und die Perlen in weiteren 100 ml PBS resuspendiert. Dies wurde dreimal wiederholt, um sicherzustellen, dass alle verbleibenden, ungebundenen Antikörper entfernt wurden.

Serum aus einer gepoolten Probe wurde mit der im Mature BDNF ELISA Kit Wako, High Sensitive (Fujifilm, Wako #298–83,901) enthaltenen Pufferlösung vierfach verdünnt. Jede Kügelchen enthaltende Lösung wurde dann in 600 µL des verdünnten Serums resuspendiert und 3 Stunden lang auf Eis unter intermittierendem Vortexen inkubiert. Anschließend wurden die Proben 30 s lang bei 12.000 G zentrifugiert und der Überstand dann in ein neues Eppendorf-Röhrchen überführt. Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt, um sicherzustellen, dass alle Protein-G-Kügelchen aus der Serumprobe entfernt wurden. Anschließend wurde die BDNF-Konzentration mithilfe des oben beschriebenen ELISA-Verfahrens gemessen.

Die Probengröße wurde mithilfe einer Leistungsberechnung (Gpower)19 ausgewählt, um einen 1,25-fachen Unterschied zwischen Serum und Plasma zu ermitteln, unter der Annahme eines Signifikanzniveaus von 0,05 und mit einer Trennschärfe von 90 % (beim Menschen ist die Konzentration von BDNF im Serum etwa zehnmal höher als). im Plasma). Die statistische Analyse wurde mit der GraphPad Prism-Software (Version 8) durchgeführt. Die Normalität der Datensätze wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test getestet (Normalitätstest bestanden, wenn Alpha = 0,05). Der Vergleich normalverteilter Gruppen wurde dann mithilfe eines ungepaarten t-Tests oder mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA zum Vergleich mehrerer Gruppen durchgeführt.

Alle Datensätze für die in dieser Studie enthaltenen Rohlumineszenz-ELISA-Messungen finden Sie in den Zusatzinformationen.

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Referenzen herunterladen

Die Finanzierung erfolgte durch das Welsh Clinical Academic Track-Programm.

School of Optometry and Vision Sciences, Cardiff University, Cardiff, CF24 4HQ, Großbritannien

Andrew Want & James E. Morgan

School of Bioscience, Cardiff University, Cardiff, CF10 3AX, Großbritannien

Yves-Alain Barde

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AW hat die Sammlung aller Plasma- und Serumproben abgeschlossen, alle ELISA-Verfahren durchgeführt und die Daten analysiert. AW und YB haben das Manuskript geschrieben. Die Projektgestaltung und -überwachung erfolgte durch YB und JEM. Alle Autoren lasen und genehmigten das endgültige Manuskript.

Korrespondenz mit Yves-Alain Barde.

Fujifilm WAKO Pure Chemical Corporation stellte die in dieser Studie verwendeten BDNF-ELISA-Kits zur Verfügung und unterstützte die Tierkosten. YB ist Berater für FUJIFILM WAKO Pure Chemical Corporation. Das Gehalt von AW wurde vom Welsh Clinical Academic Track-Programm bereitgestellt. JEM hat keine konkurrierenden Interessen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Want, A., Morgan, JE & Barde, YA. Messungen des neurotrophen Faktors aus dem Gehirn in Mausserum und -plasma unter Verwendung eines empfindlichen und spezifischen enzymgebundenen Immunosorbens-Assays. Sci Rep 13, 7740 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34262-0

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Eingegangen: 15. März 2023

Angenommen: 26. April 2023

Veröffentlicht: 12. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34262-0

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