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Aug 05, 2023

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Band Kommunikationsbiologie

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 525 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Gefäßendothelzellen (ECs) bilden eine dynamische Schnittstelle zwischen Blut und Gewebe und spielen eine entscheidende Rolle beim Fortschreiten von Gefäßentzündungen. Unser Ziel ist es, die systemweiten molekularen Mechanismen entzündlicher Endothel-Zytokin-Reaktionen zu analysieren. Mithilfe einer unvoreingenommenen Zytokinbibliothek stellten wir fest, dass TNFα und IFNγ die stärkste EC-Reaktion induzierten, was zu deutlichen proteomischen Entzündungssignaturen führte. Bemerkenswerterweise induzierte die kombinierte TNFα + IFNγ-Stimulation eine zusätzliche synergetische Entzündungssignatur. Wir verwendeten einen Multi-Omics-Ansatz, um diese Entzündungszustände zu analysieren, indem wir (Phospho-)Proteom, Transkriptom und Sekretom kombinierten, und fanden je nach Reiz ein breites Spektrum veränderter immunmodulierender Prozesse, darunter Komplementproteine, MHC-Komplexe und verschiedene sekretorische Zytokine. Die Synergie führte zu einer kooperativen Aktivierung der Transkriptinduktion. Diese Ressource beschreibt die komplizierten molekularen Mechanismen, die der Endothelentzündung zugrunde liegen, und unterstützt die adaptive immunmodulatorische Rolle des Endothels bei der Wirtsabwehr und Gefäßentzündung.

Endothelzellen (ECs) kleiden das Innere unserer Blutgefäße aus und bilden eine dynamische Schnittstelle zwischen Blut und umgebendem Gewebe. ECs erleichtern nicht nur den Austausch von Sauerstoff, Nährstoffen und Abfallprodukten, sondern kontrollieren auch die Blutstillung, indem sie Blutplättchen anlocken, um Brüche in den Gefäßwänden während der primären Blutstillung zu verschließen1. Darüber hinaus sind ECs wichtige Torwächter, die den Transport von Immunzellen in und aus dem Gewebe während einer Entzündung kontrollieren. Aufgrund ihrer Rolle in dieser adaptiven Synapse sind ECs gut dafür gerüstet, Umweltreize wie mechanischen Stress, Hormone (z. B. Vasopressin, Histamin), Zellen (z. B. Neutrophile, Monozyten, Blutplättchen) und andere äußere Reize (z. B. Thrombin) zu erfassen , Zytokine)2,3,4,5. Zusätzlich zur Transmigration von Immunzellen verfügen ECs über mehrere immunmodulatorische Fähigkeiten wie Antigenpräsentation und Zytokinsekretion5,6. Obwohl ECs über diese immunmodulierenden Eigenschaften verfügen und zu den ersten Zellen gehören, die mit Krankheitserregern in Kontakt kommen, werden sie in Immunzellnetzwerken selten erwähnt7,8,9.

Eine Deregulierung der EC-Homöostase kann zu überentzündlichen oder hyperkoagulierenden Zuständen des Endothels führen. Diese endotheliale Dysfunktion ist mit mehreren vielschichtigen entzündlichen Erkrankungen verbunden, darunter transfusionsbedingte akute Lungenschäden, Sepsis, rheumatoide Arthritis, akutes Atemnotsyndrom (ARDS), Augenvaskulopathien, chronische Nierenerkrankungen und COVID-1910,11,12,13, 14,15,16,17,18,19.

Obwohl bei diesen Krankheiten sowohl die endotheliale Homöostase als auch die Zytokine dereguliert sind, beschränkt sich die molekulare Grundlage, die adaptive Endothel-Zytokin-Wechselwirkungen orchestriert, größtenteils auf die Forschung zum Tumornekrosefaktor-alpha (TNFα). Darüber hinaus wurde in ECs ein Synergismus zwischen Zytokinen wie TNFα und Interferon-gamma (IFNy) beobachtet und mit schädlichen Auswirkungen bei entzündlichen Erkrankungen in Verbindung gebracht20,21,22,23. Obwohl zugrunde liegende Mechanismen vorgeschlagen wurden, wurde eine systemweite Reaktion der EG nicht charakterisiert.

Deshalb haben wir uns in dieser Studie zum Ziel gesetzt, die molekularen Signaturen von Endothel-Zytokin-Reaktionen zu analysieren, indem wir Blutauswuchs-Endothelzellen (BOECs), auch als endotheliale koloniebildende Zellen bekannt, aufgrund ihrer ausgedehnten, robusten Expansion als Quelle für ECs verwenden. Expression reifer vaskulärer EC-Marker und Fähigkeit zur Isolierung aus erwachsenen Spendern24,25.

Wir zeigen, dass ECs das Rezeptorrepertoire exprimieren, um verschiedene Zytokinsignale zu ermöglichen. Bei der Stimulation mit einer unvoreingenommenen Zytokinbibliothek beobachteten wir jedoch überwiegend einzigartige Entzündungszustände für TNFα und IFNγ. Darüber hinaus führte die kombinierte Stimulation von TNFα und IFNγ zu einer synergetischen EC-Reaktion. Durch die Kombination mehrerer Omics-Ebenen haben wir die molekulare Basis dieser Entzündungszustände von der Signalübertragung (Phosphoproteom) über die mRNA-Transkription (Transkriptom), die Proteinregulation (Proteom) bis zur Proteinsekretion (Sekretom) analysiert. Diese Studie deckt systemweite adaptive EC-Entzündungszustände auf, betont die Rolle von EC-Zytokin-Wechselwirkungen bei der entzündlichen Pathogenese und bekräftigt die Rolle von ECs als adaptiver Akteur bei Entzündungen.

Obwohl Gefäßentzündungen durch Zytokine gesteuert werden, die das Endothel aktivieren, ist das Wissen über Endothel-Zytokin-Wechselwirkungen auf Systemebene begrenzt. Um etablierte Interaktionen zu überprüfen, verwendeten wir immunoXpresso, eine Text-Mining-Engine, die gerichtete Zell-Zytokin-Interaktionen aus PubMed-Abstracts26 extrahiert. Von den 143 in dieser Datenbank vorhandenen Zytokinen wurde festgestellt, dass 65 mit ECs interagieren. Die meisten Studien berichten über die Wechselwirkung mit dem Zytokin TNFα und dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) (Abb. 1a). Um festzustellen, ob dies auf einen Bestätigungsfehler in der Literatur zurückzuführen ist oder ob ECs nicht die Rezeptoren exprimieren, die mit anderen Zytokinen interagieren, haben wir eine eingehende proteomische Analyse der BOECs durchgeführt, um das Rezeptorrepertoire zu bestimmen. Von 6848 quantifizierten Proteinen fanden wir 166 Rezeptoren mit bekannten Ligandeninteraktionen8 (Abb. 1b und ergänzende Abb. 1a), was zeigt, dass ECs über eine breite Palette von Rezeptoren verfügen, die mit in ihrer Mikroumgebung vorhandenen Liganden interagieren können.

Ein Balkendiagramm basierend auf immunoXpresso Data Mining, das die Anzahl der Artikel zeigt, die Wechselwirkungen zwischen Zytokinen und Endothelzellen beschreiben (Anzahl der Artikel > 5). b Cytoscape-Interaktionsnetzwerk aus Rezeptoren und potenziellen Liganden (rote Punkte: Rezeptoren, gelbe Punkte: Liganden, violette Punkte: Proteine, die sowohl Rezeptor- als auch Ligandenkriterien erfüllen), Kanten stellen STRING-DB-Scores dar. Einfügungen zeigen Zooms von beispielhaften Zytokin-Rezeptor-Interaktionen; Informationen zum Netzwerk mit Beschriftungen finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1b.

Als nächstes haben wir EC-Reaktionen auf verschiedene Zytokine profiliert und BOECs mit einer Bibliothek von 92 Signalproteinen stimuliert, basierend auf der kommerziellen Verfügbarkeit. Diese Bibliothek enthielt 46 Proteine ​​aus der ImmuneXpresso-Suche, darunter sowohl TNFα als auch FGF2 (Ergänzungstabelle 1). BOECs wurden 24 Stunden lang stimuliert und die Proteomik-Reaktionen wurden mithilfe hochauflösender, markierungsfreier quantitativer (LFQ) MS analysiert. Wir haben insgesamt 4790 Proteine ​​​​mit einem mittleren Pearson-Korrelationskoeffizienten von 0, 96 quantifiziert (ergänzende Abbildung 2). Von den 92 Signalproteinen hatten 47 einen Einfluss auf das Proteom und insgesamt waren 293 Proteine ​​unterschiedlich häufig anzutreffen (Abb. 2a). Die TNFα-Stimulation löste die stärkste Reaktion aus, gefolgt von IFNγ, IL1β und IL1α. Um die Ähnlichkeit der Reaktionen zwischen Reizen zu visualisieren, haben wir ein Netzwerk aus der Anzahl der unterschiedlich häufig vorkommenden Proteine ​​​​und der Überlappung pro Reiz erstellt (Abb. 2b und ergänzende Abb. 3a). Dabei zeigte sich, dass TNFα ein zentraler „Knoten“ ist, der mit sieben anderen Zytokinen überlappt. Die höchste Ähnlichkeit wurde zwischen TNFα, IL1α und IL1β beobachtet. Wir beobachteten auch eine Überlappung zwischen IL-33-TNFα, IL-33-Oncostatin und IL-11-MIP3. Durch koexpressionsbasiertes Clustering wurden fünf dominante EC-Antworttypen abgegrenzt (Abb. 2c). Diese bestanden aus zwei Modulen mit erhöhter Proteinhäufigkeit (Module 1 und 2: IFNγ- und TNFα/IL1α/IL1β-Antworten) und drei Modulen mit reduzierter Proteinhäufigkeit (Module 3–5, die TNFα/IL1α/IL1β, MIP5/NAP2 und MIP3/MIP3B repräsentieren). /MIP3A/Osteopontin/PF4). Proteine ​​mit hohen Modulmitgliedschaften, hervorgehobene, auf IFNγ und TNFα reagierende Proteine, Signalwandler und Aktivator der Transkription 1-alpha/beta (STAT1) und E-Selectin (SELE) für die Module 1 und 2 (Abb. 2d). Die Anreicherung der Genontologie (GO) und die Signalweganalyse27 ergaben, dass Modul 1 erwartungsgemäß hinsichtlich „Reaktion auf IFNγ“ und „IFNγ-Signalisierung“ angereichert war, während Modul 2 aus „Reaktion auf LPS“ und NF-κB-Signalisierung bestand. Modul 3 angereichert um die extrazelluläre Komponente „Kollagenhaltige extrazelluläre Matrix“ und Modul 5 um „Kit-Rezeptor-Signalweg“. Für Modul 4 gab es keine signifikante Anreicherung (Abb. 2e und ergänzende Abb. 3b, c).

ein Balkendiagramm, das die Menge an unterschiedlich regulierten Proteinen für die Reize zeigt, die das BOEC-Proteom nach 24-stündiger Stimulation veränderten (moderierter t-Test, Benjamini-Hochberg (BH) angepasster p-Wert < 0,05 und log2-fache Änderung > 1). b Zusammenfassendes Netzwerk unterschiedlich häufiger Proteine ​​zwischen Reizen. Knotenmarkierungen zeigen Zytokinreize. Die Knotengröße stellt die Menge statistisch signifikanter Proteine ​​dar. Kanten zeigen Überlappungen zwischen Proteomen, Farbintensitäten (weiß bis schwarz) der Kanten zeigen die Menge überlappender Proteine ​​im Verhältnis zum kleineren Knoten an. Siehe ergänzende Abbildung 3 für ein nicht zusammengefasstes Netzwerk. c Profildiagramme von Modulen, die Zytokin-Proteomreaktionen mit Zytokin-Annotation beschreiben. Die Gradientenskala zeigt Z-Scores des mittleren LFQ-Scores von Genen in einem Modul pro Stimulus an. Gelb: Zytokine im Zusammenhang mit einem erhöhten Häufigkeitsreaktionsprofil; Lila: Zytokine, die mit einer verminderten Reaktion auf die Proteinhäufigkeit zusammenhängen; Zytokine, die zur Modulregulierung beitragen, sind hervorgehoben. Die Replikate wurden zur Visualisierung zu Medianwerten zusammengefasst. Die Module sind durch die Farben M1 (rosa), M2 (blau), M3 (grün), M4 (rot) und M5 (gelb) gekennzeichnet. d Proteine ​​mit hohen Modulmitgliedschaftswerten, dargestellt als mittlere markierungsfreie Intensitäten (LFQ). e Angereicherte GO-Begriffe und Wikipathways pro Modul. MF-Molekularfunktion, CC-Zellkomponente, BP-biologischer Prozess.

Da TNFα und IFNγ die höchsten, überwiegend hochregulierten Reaktionen hervorriefen und über Synergismus zwischen TNFα und IFNγ berichtet wurde, haben wir die Auswirkungen der Kombination beider Zytokine untersucht. Zunächst untersuchten wir die EC-Morphologie und wie erwartet veränderten sich TNFα-stimulierte Zellen von einer runden Kopfsteinpflaster-Morphologie zu einer länglichen Form (Abb. 3a). Obwohl IFNγ keine beobachtbaren Veränderungen hervorrief, führte die Kombination beider Reize zu einer verstärkten TNFα-Morphologie, bei der alle ECs eine längliche Form und eine stärker kontrahierte Monoschicht annahmen. Basierend auf diesen Beobachtungen haben wir mithilfe von LFQ MS getestet, ob das Proteom in ähnlicher Weise beeinflusst wurde. Zunächst führten wir getrennt einen Konzentrationsbereich von TNFα und IFNγ durch und beobachteten ähnliche proteomische Profile für die Stimulation bei 10 und 100 ng/ml (ergänzende Abbildung 4). Die Stimulation mit TNFα, IFNγ und in Kombination führte zu drei unterschiedlichen Signaturen (Abb. 3b). Im Vergleich zueinander induzierten TNFα und IFNγ 74 bzw. 48 einzigartige Proteine, während die kombinierte Stimulation 111 einzigartige veränderte Proteinhäufigkeiten induzierte (Abb. 3c). Zu den einzigartigen Proteinen pro Stimulus gehörten die Transkriptionsfaktoren NFKB2 und STAT1 für TNFα bzw. IFNγ sowie das Chemokin CCL5 für die kombinierte Stimulation (Abb. 3d).

a Hellfeldbilder von unstimulierten ECs (Strg, rosa) oder ECs, die 24 Stunden lang mit TNFα (grün), IFNγ (blau) oder TNFα + IFNγ (rot) stimuliert wurden. b Hauptkomponentenanalyse (PCA) von Proteomen von ECs, die mit TNFα, IFNγ und TNFα + IFNγ stimuliert wurden. c Euler-Diagramm der Gesamtmenge einzigartiger und überlappender unterschiedlich regulierter Proteine ​​pro Stimulus (moderierter t-Test, BH-bereinigter p < 0,05 und log2-fache Änderung > 1). d LFQ-Intensitäten der Markenproteine ​​pro Stimulation.

Angeregt durch die unterschiedlichen proteomischen Signaturen von TNFα, IFNγ und kombinierter Stimulation und der Vorstellung, dass diese Zytokine Gegenstand umfangreicher Studien in ECs sind, wollten wir die molekulare Basis der beobachteten Entzündungszustände analysieren. Zu diesem Zweck verwendeten wir in einem zeitaufgelösten Experiment mehrere Omics-Ebenen (Phosphoproteom, Transkriptom und Proteom), um die Zytokinreaktionen abzugrenzen (Abb. 4a). Zur genauen Quantifizierung der Phosphopeptidspiegel verwendeten wir einen SILAC-MS-Workflow. Phosphoproteome und Proteome wurden aus derselben Probe erfasst, während transkriptomische Daten aus parallelen Stimulationen gewonnen wurden. Wir haben 4171 Proteine, 6144 Phosphosite und 60.664 Transkripte quantifiziert. Auf allen Ebenen erhöhte die TNFα + IFNy-Stimulation die Anzahl signifikanter Ereignisse im Vergleich zu Einzelreizen (Abb. 4b). Die Transkriptwerte verzeichneten den größten Anstieg der Ereignisse nach kombinierter Stimulation im Vergleich zu Einzelreizen (3,7-fach), während proteomische Ereignisse weniger anstiegen (2,3-fach). Um die Regulierungsdynamik zwischen verschiedenen Omics-Ebenen zu visualisieren, haben wir den Zeitpunkt dieser Ereignisse bewertet. In Übereinstimmung mit dem EC-Aktivierungsparadigma vom Typ 1–228 erfolgte zuerst die Phosphorregulation (0–30 m), gefolgt von transkriptomischen (4–12 h) und proteomischen Ereignissen (8–24 h) (Abb. 4c). Darüber hinaus zeigte diese Analyse unterschiedliche Dynamiken zwischen den Reizen. Die Zahl der TNFα-induzierten transkriptomischen Ereignisse nahm nach 12 Stunden ab, während diese Zahl für IFNγ stabil blieb. Als nächstes führten wir GO-Term-Anreicherungsanalysen durch und verglichen angereicherte Terme zwischen Omics-Niveaus und Stimulationen. Frühe Reaktionen, die durch Veränderungen der Phosphosite gekennzeichnet waren, spiegelten hauptsächlich mechanische Veränderungen wider (z. B. Cadherin-Bindung und fokale Adhäsion) und waren bei allen Stimulationen gleich (Abb. 4d). Die Anreicherung unterschiedlich regulierter mRNAs umfasste die GO-Begriffe „ECM-Organisation“ und „Wachstumsfaktorbindung“, während das Proteom für Antigenpräsentationsprozesse wie „MHC-Proteinkomplex“, „Peptidantigenbindung“ und den Oberbegriff „Antwort auf IFNy“ angereichert wurde. Um die zeitliche Natur der Omics-Werte zu zeigen, haben wir jeweils Beispiele aufgetragen: Phosphosit ARHGEF10 S379 sowie die Transkript- und Proteinwerte von ICAM1 (Abb. 4e). Die ARHGEF10-Phosphosite wurde innerhalb von 2 Minuten dephosphoryliert, während die mRNA-Spiegel von ICAM1 nach 30 Minuten bis 4 Stunden ihren Höhepunkt erreichten und sich nach 24 Stunden dem Ausgangswert näherten. Diesem Muster folgte ein stetiger Anstieg des Proteinspiegels, der nach 24 Stunden seinen Höhepunkt erreichte. Um zu beurteilen, wie sich das Steady-State-Repertoire von BOECs im Vergleich zu anderen EC-Typen verhält, verglichen wir unsere RNAseq-Daten mit drei veröffentlichten Studien zu verschiedenen kultivierten primären ECs innerhalb der endoDB29,30,31,32,33,34,35. Die Hauptkomponentenanalyse zeigte eine hohe Überlappung mit HUVECs bei Rombouts et al.32,34 und BOECs und Lungen-ECs bei Long et al.31,35 (ergänzende Abbildung 5a). Die Korrelation der Transkriptomsignaturen verdeutlichte jedoch auch die studienbedingte Variation (ergänzende Abbildung 5b). Die relativen Expressionsniveaus der wichtigsten EC-Gene sowie der TNFα- und IFNγ-Rezeptoren waren bei den meisten EC-Typen ähnlich (ergänzende Abbildung 5c).

a Schematischer Überblick über Zellstimulation und Multi-Omic-Workflow. b Balkendiagramm der gesamten statistisch signifikanten Ereignisse pro Stimulus auf den Ebenen Phosphoproteom (blaugrün), Transkriptom (orange) und Proteom (lila) (moderierter t-Test, BH-bereinigter p < 0,05 und log2-fache Änderung > 1). c Flächendiagramme der kumulativen zeitlichen Dynamik von Veränderungen im Phosphoproteom (blaugrüne Bereiche und durchgezogene Linien), Transkriptom (brauner Bereich und gepunktete Linien) und Proteom (violette Bereiche und gestrichelte Linien). d Kacheldiagramm der am höchsten angereicherten GO-Terme pro Stimulation: IFNγ (rosa), TNFα (orange), TNFα + IFNγ (grün) und Omics-Level (wie angegeben). Farbverlauf angegeben – log10 BH-bereinigte p-Werte. MF-Molekularfunktion, CC-Zellkomponente, BP-biologischer Prozess. e Liniendiagramme von Phosphorylierungsereignissen, Transkriptmengen und relativen Proteinhäufigkeiten von Mitgliedern hochangereicherter GO:terms. Kreise geben Mediane an; Fehlerbalken zeigen Standardabweichungen (n = 3 biologische Replikate).

Um die Prozesse zu visualisieren, die entweder durch TNFα, IFNγ oder kombinierte Stimulation gesteuert werden, haben wir eine Karte der EC-Reaktionen erstellt. Zunächst klassifizierten wir alle unterschiedlich regulierten Phosphosite, Transkripte und Proteine ​​als „TNFα“, „IFNγ“, „gemeinsam“, „TNFα + IFNγ“ oder „nicht klassifiziert“, basierend auf Effektgrößen und dynamischem Verhalten im Zeitverlauf (Abb. 5a). . Für Phosphosites wurden die meisten Treffer als „häufig“ klassifiziert, während sowohl für mRNA als auch für Protein „IFNy“ der am weitesten verbreitete Klassifikator war (1850 Transkripte und 60 Proteine), gefolgt von „TNFα + IFNγ“ (1235 und 45) und „TNFα“ ( 948 und 34) (Abb. 5b). Als Beispiel für jede Klassifizierung haben wir die hochkorrelierenden Transkripte NFKBIE („TNFα“), SECTM1 („IFNγ“), PARP10 („common“) und CCL8 („TNFα + IFNγ“) aufgetragen (Abb. 5c). Als nächstes haben wir regulierte Funktionen verbunden, indem wir die STRING-Datenbank nach Interaktionen mit hoher Konfidenz (>0,95) abgefragt haben. Dies führte zu einem Netzwerk mit 2306 Interaktionen, das 9 hochdichte Hubs enthüllte, die in biologischen Prozessen zusammengefasst sind: „Viralsensoren“, „Zytokine“, „Komplementfaktoren“, „JAK/STAT-Signalisierung“, „Zellzyklus“, „NFKB-Signalisierung“. , „Proteasom“, „NFKB-Komplex“ und „Antigenpräsentation“ (Abb. 5d und ergänzende Abb. 6). Bei der Darstellung des Verhältnisses der Antwortklassifizierungen pro Hub wurden nur zwei hauptsächlich durch TNFα induziert: Proteine ​​des NF-κB-Komplexes (47 % TNFα) und Zytokine (44 % TNFα), während alle anderen hauptsächlich durch IFNγ induziert wurden. Insbesondere die Hubs „Komplementfaktoren“, „Viralsensoren“, „Proteasom“ und „Antigenpräsentation“ waren überwiegend IFNγ-induziert (>75 %). Keiner der Hubs wurde hauptsächlich synergistisch induziert, was darauf hindeutet, dass die Synergie auf bestimmte Proteine ​​und nicht auf ganze biologische Prozesse beschränkt ist.

a Schematischer Überblick über die Generierung des Interaktionsnetzwerks aus signifikanten Ereignissen. b Balkendiagramm, das das Verhältnis der Antwortklassifizierung und die Gesamtzahl der Knoten pro Klassifizierung und Omics-Ebenen (wie angegeben) zeigt. c Liniendiagramme der normalisierten Transkriptniveaus (VST) stark korrelierender Klassifizierungstranskripte. Farben zeigen den Reiz an: TNFα (grün), IFNγ (blau), TNFα + IFNγ (rot). Kreise geben die Mediane der Replikate an; Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung (n = 3 biologische Replikate). d Interaktionsnetzwerk aller unterschiedlich regulierten mRNAs/Proteine ​​und Phosphosites, gefiltert nach Interaktionen mit hoher Konfidenz, Knoten repräsentieren Transkripte/Proteine ​​und Phosphosites. Der Farbverlauf zeigt die mittleren Transkriptwerte bei 24-Stunden-TNFα + IFNγ-Stimulation an (n = 3 biologische Replikate). Pro Cluster sind angegeben: zusammenfassender biologischer Prozess, die drei wichtigsten regulierten Transkripte und angereicherte biologische Prozesse. Das Donut-Diagramm zeigt das Verhältnis der Antwortklassifizierung in jedem Cluster: TNFα (grün), IFNγ (blau), TNFα + IFNγ (rot), häufig (orange) und keine Klassifizierung (grau).

Um biologische Prozesse aus dieser Multi-Omics-Integration abzugrenzen, haben wir die IFNγ-induzierten Prozesse analysiert, da diese hauptsächlich immunvermittelnde Prozesse abdeckten. Der Hub „virale Sensoren“ enthält die angeborenen antiviralen Proteine ​​IFIT2, IFIT3, IFIH1, DDX58 sowie GPB1 und GBP2, die alle durch IFNγ induziert wurden (Abb. 6a). Interessanterweise ist DDX58 ein Beispiel für begrenzte Faltungsänderungen in Transkripten (maximal 1-fach), obwohl Proteinveränderungen im Allgemeinen zu späteren Zeitpunkten auftreten und geringere logarithmische Faltungsänderungen als mRNA hervorrufen, während Proteinveränderungen um mehr als das Dreifache zunehmen. Komplementfaktoren waren ein weiterer stark induzierter IFNγ-Hub, insbesondere C1R und C1S zeigten eine drastisch erhöhte Hochregulierung der Transkripte (>5-fach) (Abb. 6b). C3, das für die Aktivierung des alternativen Signalwegs von entscheidender Bedeutung ist, ist das einzige ausschließlich TNFα-induzierte Transkript in diesem Hub. Es ist jedoch unklar, ob die in Proteine ​​übersetzte Transkriptexpression zunimmt, da entsprechende Proteine ​​nicht nachgewiesen wurden. IFNγ induzierte auch einen starken Antigen-präsentierenden Hub (Abb. 6c). Wir haben zuvor berichtet, dass TNFα MHCI-Proteine ​​induziert, einschließlich HLA-A, HLA-B und HLA-C, was wir auch hier beobachtet haben36. Allerdings sind diese MHCI-Komplexproteine ​​sowie Immunproteasom- (PSMB8, PSMB9 und PSMB10) und Immunproteasom-Regulator-Untereinheiten (PSME1 und PSME2), Peptid-Beladungsproteine ​​(TAP1, TAP2, ERAP1 und ERAP2)37,38 und das Immun-Checkpoint-Protein Programmierter Todesligand 1 (CD274) wurden durch IFNγ stärker induziert als durch TNFα. Darüber hinaus induzierte IFNγ auch MHCII-Komplexe, die für die exogene Antigenpräsentation erforderlich sind. HLA-DR-, HLA-DQ- und HLA-DP-Transkripte wurden nach 12–24 Stunden IFNγ-Stimulation um das 4–7-fache hochreguliert. Interessanterweise konnten wir HLA-DRA und HLA-DRB im Gegensatz zu MHCI-Proteinen, die auf Proteinebene reichlich nachgewiesen wurden, nur in separaten LFQ-Workflow-Experimenten nachweisen (ergänzende Abbildung 7a). Um die Diskrepanz zwischen der MHCI- und MHCII-Proteinexpression sichtbar zu machen, haben wir BOECs nach Stimulation von TNFα, IFNγ oder kombinierter Stimulation auf HLA-A/B/C oder HLA-DR gefärbt. MHCI zeigte eine klare Verteilung über die Zellmembran, auch im Steady-State-Zustand (ergänzende Abbildung 7b) und im Einklang mit Transkriptom- und Proteindaten wurde HLA-DR nur unter IFNγ-stimulierten Bedingungen beobachtet. Im Gegensatz zur Membranverteilung von HLA-A/B/C war HLA-DR jedoch hauptsächlich in Kompartimenten innerhalb der Zelle lokalisiert (Abb. 6d).

a Übersicht über regulierte angeborene Immunsensoren im Hub „Viralsensoren“, b im Hub „Komplementfaktoren“ und c im Hub „Antigenpräsentation“. Balkendiagramme der hervorgehobenen Transkripte/Proteine ​​zeigen das mittlere Transkriptniveau (VST) oder das Protein-SILAC-Verhältnis pro Stimulus und Zeitpunkt (n = 3 biologische Replikate). Farben zeigen den Reiz an: TNFα (grün), IFNγ (blau), TNFα + IFNγ (rot). Die Knotenfüllung zeigt die Antwortklassifizierung des Transkripts an: TNFα (grün), IFNγ (blau), TNFα + IFNγ (rot), häufig (orange) und keine Klassifizierung (grau). d Konfokale Bilder von HLA-DR-Immunfärbung in unstimulierten ECs (Strg, rosa) und stimuliert mit TNFα, IFNγ und TNFα + IFNγ. Die HLA-DR-Färbung ist in Grün dargestellt, die Hoechst-Färbung in Cyan. Repräsentatives Experiment dargestellt (n = 3 biologisch unabhängige Experimente). Die Obergrenze des Anzeigebereichs wurde zu Visualisierungszwecken für alle Bilder gleichmäßig angepasst.

Als nächstes untersuchten wir, ob die Regulation zwischen den beiden Hauptsignalachsen NF-κB und JAK/STAT den beobachteten Entzündungszuständen zugrunde liegen könnte. Wie erwartet wurden Mitglieder des NKFB-Komplexes wie NFKB2 (P100), NFKB1 (P40) und RELB als „TNFα“ klassifiziert, während Schlüsselmediatoren des JAK/STAT-Signalwegs, JAK1, JAK2, STAT1, STAT2 und STAT3, alle als „TNFα“ klassifiziert wurden „IFNγ“ (Abb. 7a). Interessanterweise wurden Transkripte der IFNγ-Rezeptoren IFNGR1 und IFNGR2 durch TNFα induziert, während die TNFα-Rezeptoren TNFR1 und TNFR2 in der NF-κB-Signalachse durch IFNγ induziert wurden. Die Auftragung der Effektgröße jedes Reizes als Verhältnis zur gesamten beobachteten kombinatorischen Reaktion zeigt, dass beide Signalkaskaden unterschiedliche Antwortklassifizierungen zeigten und Transkripte nicht ausschließlich durch ein Zytokin reguliert wurden (Abb. 7b).

a Schematischer Überblick über die Signalachsen NF-κB und JAK/STAT. Die Füllfarbe der Knoten zeigt die Antwortklassifizierung der Transkripte an: TNFα (grün), IFNγ (blau), TNFα + IFNγ (rot), häufig (orange) und keine Klassifizierung (grau). b Kreisdiagramme der Transkript-AUC als Teil der gesamten TNFα + IFN-Antwort: TNFα (grün), IFNγ (blau), [TNFα + IFNγ] – TNFα – IFNγ (rot). c Liniendiagramme der synergistischen Transkriptniveaus und SILAC-Verhältnisse korrelierender Proteine ​​nach TNFα-, IFNγ- und TNFα + IFNγ-Stimulation. Die Summe der einzelnen TNFα- und IFNγ-Regulationen ist grau dargestellt. Kreise geben die Mediane der Replikate an; Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung (n = 3 biologische Replikate).

In einer Reihe von Transkripten entsprach die kumulative Wirkungsgröße von TNFα und IFNγ nicht der Gesamtreaktion der kombinierten Stimulation, was auf eine synergistische Beziehung hinweist. Dazu gehörten die Transkriptionsfaktoren RELA, STAT5A und STAT6, JAK3, eine zentrale Kinase bei der IFN-Signaltransduktion39, und LCP2, das an der T-Zell-Antigenrezeptor-vermittelten Signalübertragung beteiligt ist40 (Abb. 7c). Wir beobachteten auch eine synergetische Herunterregulierung von PECAM1, einem entscheidenden Molekül für die Aufrechterhaltung der EC-Zellverbindungen41. Die synergetische Regulierung von Transkripten wirkte sich nicht in gleichem Maße auf die Proteinspiegel aus. Erst zum 24-Stunden-Zeitpunkt überstiegen die korrelierenden Proteinhäufigkeiten im TNFα + IFNγ-Zustand die kumulative Häufigkeit beider Zytokinstimuli getrennt.

Die Zytokinfreisetzung durch ECs ist ein direkter Weg der Immunmodulation durch Interaktion mit verschiedenen Immunzellen, und sowohl TNFα als auch IFNγ induzierten unterschiedliche Zytokintranskripte und synergetische Steigerungen. Allerdings wurde der Großteil der Zytokine nicht auf Proteinebene nachgewiesen, möglicherweise aufgrund der geringen Häufigkeit und sekretorischen Natur der Zytokine42. Daher führten wir Sekretomik-Experimente durch und folgten dabei dem von Deshmukh et al.43 beschriebenen Arbeitsablauf. Sowohl Sekretome als auch Zelllysate wurden mittels hochauflösender LFQ-MS analysiert (Abb. 8a). Zeitabhängige Veränderungen waren im Sekretom am deutlichsten, da Proteine ​​im Laufe der Zeit in den Überstand ausgeschieden wurden (ergänzende Abbildung 8) und wir beobachteten begrenzte Proteinveränderungen aufgrund der Stimulation zu frühen Zeitpunkten (30 m und 4 h). Nach 24 Stunden induzierten jedoch sowohl TNFα als auch IFNγ 29 bzw. 54 signifikante Proteine, und dieser Effekt wurde im kombinierten Zustand verstärkt (177 Proteine) (Abb. 8b). Die Erzeugung eines STRING-Interaktionsnetzwerks aus hochregulierten Proteinen in der kombinierten Stimulation ergab 6 Protein-Hubs, die sich mit extrazellulären Proteinen wie extrazellulärer Matrix, Komplementproteinen und Zytokinen/Chemokinen anreichern (Abb. 8c). Zwei Hubs enthielten intrazelluläre Proteine, nämlich ribosomale Einheiten und mitochondriale Proteine, was auf einen erhöhten Zelltod hinweist. Als nächstes verwendeten wir das ImmPort Cytokine Registry, um einen Überblick über alle in diesem Experiment sezernierten Zytokine (n = 44) zu erstellen und die intrazelluläre Proteinhäufigkeit und die Transkriptomdaten aufzuzeichnen (Abb. 8d). In Übereinstimmung mit den oben beschriebenen Entzündungssignaturen beobachteten wir unterschiedliche Zytokine, die pro Stimulus sezerniert wurden (13 für TNFα und 3 für IFNγ), Zytokine, die von beiden Stimuli gleichermaßen ausgeschieden wurden (CSF1 und CXCL10) und 21 Zytokine, die von einem Stimulus nicht beeinflusst wurden und konstitutiv exprimiert wurden (z. B , PDGFB). Die synergistische Induktion der CCL5-, CCL8-, CXCL9- und IL6-Transkripte führte zu erhöhten sekretierten Proteinspiegeln, bei letzteren waren die Faltungsänderungen jedoch weniger ausgeprägt. Interessanterweise zeigte IL6 zwar geringfügige mRNA-Anstiege, war aber im Sekretom reichlich vorhanden. Um einen Einblick in die mutmaßlich betroffenen Zelltypen zu erhalten, verwendeten wir die Text-Mining-Datenbank ImmunXpresso und zeichneten die Anzahl der Zitate auf, die Zytokin-Zell-Interaktionen pro freigesetzter Zytokin-Untergruppe beschreiben. Für TNFα-induzierte Zytokine wurden in den meisten Zitaten Wechselwirkungen mit Neutrophilen (n = 566) beschrieben, gefolgt von Makrophagen und T-Zellen, während IFNy-freigesetzte Zytokine hauptsächlich für Makrophagen (n = 140), Knochenzellen (Markzellen) und T-Zellen zitiert wurden ( Abb. 8e). Synergistisch freigesetzte Zytokine (CCL5, CCL8, CXCL9 und IL6), angereichert für Arbeiten zu T-Zellen (n = 153), B-Zellen und Knochen-(Mark)-Zell-Interaktionen, was darauf hindeutet, dass jeder EC-Entzündungszustand Interaktionen mit verschiedenen Immunzelltypen begünstigt.

a Schematischer Überblick über den Secretomics-Workflow. b Balkendiagramm der Anzahl signifikant regulierter Proteine ​​pro Stimulus (moderierter t-Test, BH-bereinigter p < 0,01 und log2-fache Änderung > 1). Farben zeigen den Reiz an: TNFα (grün), IFNγ (blau), TNFα + IFNγ (rot). c Interaktionsnetzwerk unterschiedlich regulierter Proteine ​​nach 24-stündiger TNFα + IFNγ-Stimulation, wobei der Proteintyp pro Hub in Grau dargestellt ist. d Heatmap der angereicherten Proteine ​​im Zytokinregister pro Omics-Ebene, die korrelierende Transkripte und Proteine ​​im Lysat nach TNFα-, IFNγ- und TNFα + IFNγ-Stimulation zeigt. Der Farbverlauf zeigt Z-Scores an. Mehrere Proteine ​​werden in Liniendiagrammen mit VST- und LFQ-Werten hervorgehoben, Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung (n = 3 biologische Replikate). e Anzahl der Arbeiten, die die Zelltypinteraktionen durch pro Stimulation induzierte Zytokine anreichern. Die Knotengröße stellt die Anzahl der Arbeiten dar, der größte Knoten pro Stimulus ist auf den am häufigsten zitierten Zelltyp eingestellt (TNFα: n Zitate = 566, IFNγ: n = 140, TNFα + IFNγ: n = 153).

ECs stehen an der Schnittstelle von Entzündung und Hämostase und werden zunehmend für ihre immunmodulatorische Rolle anerkannt. Wir zeigen, dass TNFα und IFNγ systemweite adaptive EC-Entzündungszustände induzieren. Darüber hinaus induzierte die Kombination von TNFα und IFNγ eine synergistische EC-Reaktion. Diese Studie bietet eine detaillierte molekulare Kartierung auf mehreren Regulierungsebenen und bietet eine umfangreiche Ressource zur zugrunde liegenden Regulierung endothelialer Entzündungen.

Wie allgemein bekannt ist, tragen ECs direkt durch die TNFα-induzierte Hochregulierung von VCAM1, ICAM1 und SELE zur Migration von Immunzellen bei28,36,44. Hier zeigen wir, dass ECs zusätzlich zu TNFα eine Vielzahl von Zytokinen wahrnehmen und auf Proteomebene reagieren können, die Reaktion bleibt jedoch für die meisten begrenzt. Darüber hinaus beobachten wir eine große Überlappung zwischen verschiedenen Reizen, insbesondere den gemeinsamen Reaktionen des TNFα-Clusters sowohl mit IL1-α als auch mit IL1-β, in Übereinstimmung mit früheren Berichten 36, 45. Die beiden anderen überlappenden Cluster enthielten hauptsächlich Chemokine, was die relativ begrenzte proteomische Reaktion erklären könnte. Einige davon, wie MIP3a (CCL20) und MIP5 (CCL15), sind an Transmigrationsprozessen von Monozyten und dendritischen Zellen beteiligt46,47, was darauf hindeuten könnte, dass diese Chemokine spezifische Transmigrationsprozesse beeinflussen, anstatt zellweite proteomische Veränderungen auszulösen.

Die IFNγ-Stimulation führte zur zweithöchsten Reaktion, die mit keinem der anderen Zytokine überlappte und die immunmodulierenden Fähigkeiten von ECs hervorhob. IFNγ induzierte eine starke Hochregulierung antiviraler Proteine ​​und Komplementproteine. Von Letzterem beobachteten wir die Sekretion von C1R, C1S und CFB in die extrazelluläre Matrix, was den Beitrag von ECs zur Regulierung der Komplementkaskade zeigt. Wie erwartet induzierte IFNγ auch einen starken Anstieg der MHCII-Komplexproteine. ECs spielen eine Rolle als modulierende Antigen-präsentierende Zellen, regulieren die Toleranz und Transmigration von CD8+- und CD4+-T-Zellen und spielen eine Rolle bei der Abstoßung von Allotransplantaten48,49,50. Obwohl MHCII in vivo konstituierend exprimiert wird, ergab unsere konfokale Analyse interessanterweise, dass HLA-DR-Proteine ​​nach 24-stündiger Simulation nicht an der Zelloberfläche exprimiert wurden, sondern größtenteils auf intrazelluläre Kompartimente beschränkt waren. Dies könnte ein Artefakt der In-vitro-Kultivierung sein, die den Transport von HLA-DR-Proteinen zur Zelloberfläche unterbindet, und möglicherweise längere Stimulationsfenster, oder es ist ein sekundärer Auslöser erforderlich, um die Zelloberflächenexpression zu erleichtern51,52. Zusätzlich zu den internen molekularen Mechanismen besteht ein weiterer Weg der endothelialen Immunmodulation in der extrazellulären Kommunikation in Form freigesetzter Signalproteine. Im Einklang mit intrazellulären Prozessen wurden je nach Reiz unterschiedliche Proteine ​​ausgeschüttet. TNFα ist im Zusammenhang mit der Neutrophilentransmigration gut untersucht, und die nach der TNFα-Stimulation freigesetzten Zytokine reichern sich tatsächlich hauptsächlich für Arbeiten zu Neutrophileninteraktionen an. Die IFNγ-Stimulation induzierte die Sekretion von CXCL9, CXCL10 und CXCL11, die alle über den CXCR3-Rezeptor signalisieren, der hauptsächlich auf Monozyten, T-Zellen, NK-Zellen und dendritischen Zellen vorhanden ist53,54. Allerdings induziert TNFα nicht ausschließlich Granulozyten-Lockstoffe (z. B. CCL20 und CX3CL1) und die meisten Chemokine haben chemoattraktive Eigenschaften für mehrere Leukozyten55. Kombiniertes TNFα und IFNγ erhöhten synergistisch die CCL5-, CCL8-, CXCL9- und IL6-Spiegel und differenzierten so weiter, welche Immunzellen vom Endothel bevorzugt werden. Darüber hinaus wird IL6 mit entzündlichen Erkrankungen in Verbindung gebracht und gilt als Marker für die Schwere der Erkrankung, beispielsweise bei ARDS und COVID-1956,57.

Der Vergleich der zeitlichen Natur der TNFα- und IFNγ-Antworten zeigte unterschiedliche Dynamiken zwischen mRNA und Proteom, während beide Zytokine eine ähnliche unmittelbare Phospho-Signalisierungsreaktion induzierten. Auf Transkriptomebene induzierte TNFα eine unmittelbarere Reaktion, die im Allgemeinen innerhalb von 24 Stunden abnahm. Interessanterweise kann die TNFα-induzierte Expression von Oberflächenadhäsionsmolekülen wie VCAM1 mehrere Tage andauern, was darauf hindeutet, dass eine kleine Induktion eine dauerhafte Proteinexpression induzieren kann58,59. Im Gegenteil, die IFNγ-induzierte mRNA-Expression nimmt im Laufe der Zeit stetig zu und erreicht nach 24 Stunden, dem Endpunkt dieser Studie, maximale Transkriptwerte. Ob die IFNγ-Reaktion anhält, muss noch geklärt werden, aber Studien haben gezeigt, dass die Proteomreaktion nach kurzfristigen (3 Stunden) IFNγ-Simulationsfenstern 48 Stunden lang anhält60.

Die synergetischen Effekte der kombinierten TNFα- und IFNγ-Stimulation in ECs wurden in früheren Berichten beobachtet21,22,23 und im Einklang mit diesen Beobachtungen führte die Kombination von TNFα und IFNγ auch zu einer systemweiten kooperativen Regulierung. Allerdings war die Proteininduktion im Vergleich zu synergetischen mRNA-Erhöhungen im Allgemeinen weniger ausgeprägt und Veränderungen in der Proteinhäufigkeit traten hauptsächlich zwischen 12 und 24 Stunden auf, was darauf hindeuten könnte, dass die Synergie im Proteom zu späteren Zeitpunkten stärker sichtbar wird. Die molekulare Grundlage des synergetischen Zusammenspiels kann vielfältig sein. Ein Mechanismus könnte eine erhöhte mRNA-Expression durch beide Zytokine sein. Beispielsweise wird berichtet, dass CXCL10 über zwei Transkriptionsfaktor-Bindungsregionen verfügt, eine für NF-κB und eine für das Interferon-empfindliche Antwortelement22,61, und wir beobachten tatsächlich, dass die kombinierte Stimulation eine Summe beider separater Reize darstellt. Andere Studien haben veränderte mRNA-Halbwertszeiten durch Zytokinstimulation beschrieben62. Beispielsweise kann CCL5-mRNA durch IFNγ-Stimulation stabilisiert werden, und wir beobachten tatsächlich einen synergetischen Anstieg der mRNA-Spiegel in Kombination mit TNFα, obwohl IFNγ allein keine Transkriptexpression induziert63,64. Im Gegensatz dazu könnte die synergetische Abnahme der PECAM1-Transkripte durch eine Zytokin-induzierte mRNA-Destabilisierung erklärt werden65. Darüber hinaus werden diese Mechanismen spezifisch pro Protein reguliert. Beispielsweise zeigen CCL5 und CCL8, beides synergistisch induzierte Proteine, entgegengesetzte Induktionsmuster: Bei CCL5 induziert TNFα mRNA und IFNy stabilisiert, während bei CCL8 diese Rollen umgekehrt sind.

Die Aktivierung verschiedener NF-κB- und STAT-Transkriptionsfaktoren scheint den unterschiedlichen Entzündungszuständen zugrunde zu liegen, und wir beobachten ein Übersprechen in den beiden Hauptaktivierungswegen dieser Transkriptionsfaktoren. Insbesondere die synergetische Induktion von Schlüsselmediatoren dieser Signalachsen wie dem NF-κB-Komplexprotein RELA und JAK3 und STAT5A/6 lässt auf eine unterschiedliche Aktivierung von Transkriptionsprogrammen durch kombinierte Stimulation schließen. Unter Berücksichtigung der Wechselwirkungen zwischen Transkriptionsfaktoren wie NF-κB, Interferon-Regulierungsfaktoren und STATs22,66 erhöht dies die Komplexität der Regulierung, die Entzündungszustände auslöst, drastisch. Wenn wir unsere Ergebnisse in den Kontext der In-vivo-Regulierung stellen, sollten wir die Einschränkungen dieser Studie berücksichtigen. Wir verwenden BOECs als unser In-vitro-Modell, die weniger gut charakterisiert sind als andere verwendete EC-Modelle wie HUVECs. Es wurde jedoch gezeigt, dass BOECs reife EC-Marker über mehrere Passagen exprimieren, aufgrund ihrer umfassenden Proliferationsfähigkeit für metabolische Markierungsstrategien bevorzugt werden und direkt von erwachsenen Spendern und Patienten abgeleitet werden können24,25,67,68,69. Auch die Variabilität der Spender-zu-Spender-Reaktionen gibt Anlass zur Sorge70,71, aber in dieser Studie verwendeten wir BOECs von 19 verschiedenen Spendern (Ergänzungstabelle 2) und beobachteten durchgehend konsistente Entzündungssignaturen. Auch Wachstumsbedingungen kultivierter ECs wie verwendete Matrix, 3D-Kultivierung oder Fluss könnten sich auf das Entzündungsergebnis auswirken. Obwohl ECs ihre zelluläre Organisation und ihre phänotypischen Eigenschaften verändern, scheinen durch Entzündungsauslöser induzierte Proteine ​​zwischen den Kulturbedingungen konserviert zu sein, was darauf hindeutet, dass diese Zusätze die Entzündungsreaktion nuancieren, anstatt die aktivierten Prozesse abzuwechseln72,73. Idealerweise würde ein In-vitro-Modell verwendet werden, das Fluss- und 3D-Kultivierung kombiniert, aber diesen Modellen mangelt es oft an Robustheit und Durchsatz. ECs sind auch zwischen verschiedenen Organen und Gefäßtypen heterogen74 und es ist unklar, wie Entzündungsprozesse in ECs verschiedener Gefäßbetten reguliert werden. Eine wichtige Unterscheidung bei vaskulären entzündlichen Erkrankungen ist die zwischen Mikro- und Mikrogefäßsystem. Obwohl Studien gezeigt haben, dass aus dem Makro- oder Mikrogefäßsystem abgeleitete ECs ihre spezifischen Unterschiede in der Kultur beibehalten75, ist es schwierig zu beurteilen, ob BOECs einen makro- oder mikroähnlichen Gefäßtyp annehmen, wenn sie sich innerhalb der In-vitro-Mikroumgebung differenzieren. Der Vergleich von Steady-State-mRNA-Daten verdeutlichte die Herausforderungen bei der Bewertung der EC-Variation über mehrere Studien hinweg. Wir beobachteten insgesamt ähnliche relative Expressionsniveaus von EC-Markern und TNFα- und IFNγ-Rezeptoren, was darauf hindeutet, dass die beobachteten Zytokinreaktionen möglicherweise auch auf andere EC-Typen übertragen werden könnten30,31,32. Die Beurteilung, ob diese Entzündungszustände zwischen verschiedenen Gefäßbetten bestehen bleiben, ist ein entscheidender Schritt in zukünftigen Studien zum Verständnis gewebespezifischer EC-Entzündungen. Zusammenfassend liefert diese Studie einen detaillierten Einblick in die Entzündungszustände des Endothels, die durch eine komplexe Transkriptions- und Translationskontrolle reguliert werden. Die Aufdeckung dieser molekularen Mechanismen ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Wege, die zu einer endothelialen Dysfunktion und ihrem Beitrag zur Gefäßentzündung führen.

BOECs wurden aus gesunden Spendern isoliert, wie von Ramirez et al.24 beschrieben. Für alle Experimente mit Ausnahme der Multi-Omics- und Sekretom-Experimente wurden drei verschiedene Pools von drei einzigartigen BOEC-Spendern (gemischtes Geschlecht und Alter) verwendet (Ergänzungstabelle 2). Für die Multi-Omics- und Sekretom-Experimente wurden BOECs von drei verschiedenen Spendern (gemischten Geschlechts und Alters) gepoolt. Kulturflaschen und -schalen wurden vor der Verwendung 1 Stunde lang mit Kollagen Typ I (50 µg/ml, BD Biosciences) beschichtet. Sofern nicht anders angegeben, wurden die Zellen in EC-Basalmedium (Lonza), ergänzt mit 18 % FCS (Bodinco) und EGM-Bulletkit (Lonza), kultiviert. Für die SILAC-Markierung wurden BOECs für 5 Passagen aufrechterhalten, wie von Beguin et al.36 beschrieben, in maßgeschneidertem EGM-Medium (Lonza), das EBM2-Medium (ohne Arganin und Lysin) (Lonza), EGM-Bulletkit (Lonza) und 18 % FCS für die Passagen 1–3 und in 18 % 1 kDa dialysiertes FCS für die Passagen 4–5. Die Zellen wurden durch Zugabe isotopenmarkierter Aminosäuren während aller Passagen mit SILAC markiert (leicht: Arg0 und Lys0, mittel: Arg6 und Lys4, schwer: Arg10 und Lys8, Cambridge Isotopes). Nach fünf Passagen erreichte der Einbau markierter Aminosäuren >95 % im Gesamtproteom.

Alle zur Stimulation verwendeten rekombinanten menschlichen Zytokine wurden von Peprotech bezogen (Ergänzungstabelle 1). ECs wurden in drei biologischen Replikaten mit 10 ng/ml pro Zytokin zu den angegebenen Zeitpunkten stimuliert, mit Ausnahme von Dosis-Wirkungs-Experimenten, bei denen Zellen mit 1, 10 und 100 ng/ml stimuliert wurden. Vor der Stimulation wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und die Stimulationen wurden in Endothel-Basalmedium (Lonza), ergänzt mit 18 % FCS (Bodinco) und EGM-Bulletkit (Lonza), durchgeführt, mit Ausnahme von SILAC BOECs und Sekretom-Experimenten. Den SILAC-BOECs wurde vor der Stimulation 2 Stunden lang das Serum entzogen und sie wurden in endothelialem Basalmedium (Lonza) ohne Zusätze stimuliert. Stimulationen in Sekretomexperimenten wurden in phenolrotfreiem Endothel-Basalmedium (Promocell) ohne jegliche Zusätze durchgeführt.

BOECs wurden bis zur Konfluenz auf kollagenbeschichteten Glasdeckgläsern gezüchtet. Nach 4 Tagen wurden die Zellen entweder nicht stimuliert oder mit TNFα, IFNγ oder TNFα + IFNγ stimuliert, wie oben beschrieben. Die Zellen wurden mit 4 % PFA (Thermo Scientific) fixiert, dreimal mit PBS gewaschen und mit 50 mM Ammoniumchlorid (Sigma-Aldrich) gequencht. Die Schritte zur Antikörperfärbung wurden in 1 % BSA (Serva) und 0,1 % Saponin (Sigma-Aldrich) durchgeführt, um die Zellen zu permeabilisieren. MHCI wurde mit pan-HLA-monoklonalem W6/32-Maus-Antikörper aus Hybridomen (ATCC, HB-95) gefärbt, HLA-DR wurde mit monoklonalem L243-Anti-Human/Affen-Antikörper (InVivoMAb, BE0306) gefärbt, jeweils 10 µg/ml . Für beide Färbungen wurde Alexa Fluor 488 Huhn-Anti-Maus-konjugierter Sekundärantikörper (2 µg/ml) verwendet (Invitrogen, Nr. A21200). Die Folien wurden in Mowiol 4-88 (Polysciences) fixiert. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop SP8 (Leica) mit einem 40×/1,30-Ölobjektiv (Leica, 11506359) bei einer Auflösung von 1024 × 1024 aufgenommen. Die Bilder wurden mit Fiji76 verarbeitet. Die Immunfärbung wurde dreimal in unabhängigen Experimenten durchgeführt.

Für die RNAseq-Analyse verwendete Zellen wurden in RLT-Puffer (QIAGEN) gemäß dem Protokoll des Herstellers lysiert. Die RNA-Sequenzierung wurde von GeneWiz (Azenta Life Sciences) durchgeführt, einschließlich RNA-Isolierung, Bibliotheksvorbereitung, strangspezifischem RNAseq mit PolyA-Selektion und Illumina-Paired-End-150-bp-Sequenzierung. Nach der Qualitätskontrolle mit FastQC wurden die Sequenzen mit STAR 2.7.8a an der menschlichen ChGR38.104-Genomreferenz ausgerichtet und die Lesevorgänge mit featureCounts 2.0.1 zusammengefasst. Die Analyse der differentiellen Expression wurde mit DESeq277 durchgeführt, wobei ein Signifikanzschwellenwert eines durch Benjamini-Hochberg (BH)-Mehrfachtests korrigierten p-Werts von <0,05 und eine log2-fache Änderung von >1 angewendet wurde.

Für die massenspektrometrische Analyse von EC-Proteomen wurden die Zellen in 1 % Natriumdesoxycholat (Bioworld), 10 mM TCEP (Thermo Scientific), 40 mM Chloracetamid (Sigma-Aldrich), 100 mM Tris-HCl pH 8,0 (Gibco), ergänzt mit 1, lysiert × HALT-Protease-/Phosphatase-Inhibitor (Thermo Scientific). Die Lysate wurden 5 Minuten lang bei 95 °C inkubiert und 10 Minuten lang in einem Ultraschallbad (Branson Modell 2510) beschallt. Anschließend wurde Trypsin (Promega) in einem Proteinverhältnis von 1:50 (Gew./Gew.) zugegeben. Die Peptide wurden mit C18-Kartuschen (Agilent) gemäß den Anweisungen des Herstellers entsalzt und gegebenenfalls wurde die Phosphopeptidanreicherung unter Verwendung von Fe(III)-IMAC-Kartuschen (Agilent) wie von Post et al.78 beschrieben auf einem AssayMAP BRAVO (Agilent) durchgeführt. Für das tiefe Proteom wurde das Protein zunächst mit HyperSep C18-Kartuschen (Thermo Scientific) und HyperSep Hypercarb SPE-Kartuschen (Thermo Scientific) gereinigt. Anschließend wurden die Proben mit dem Pierce High pH-Umkehrphasen-Peptidfraktionierungskit (Thermo Scientific) fraktioniert und die Fraktionen mit Empore C18 STAGE-Spitzen (Supelco) entsalzt. Die Fraktionierung wurde im Dreifachverfahren durchgeführt und die erhaltenen Fraktionen wurden separat gemessen. Für die Sekretomanalyse wurden die Proben mit geringfügigen Anpassungen wie in Deshmukh et al.43 beschrieben aufgearbeitet. Zunächst wurden die Überstände gesammelt und mit einem 0,2-μm-Filter (Whatman) filtriert. Die gesammelten Überstände wurden bei 5000 g zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen, und vor der weiteren Verwendung bei –80 °C gelagert. Die Proben wurden mit Aceton (Verhältnis 1:4, Biosolve) über Nacht bei –20 °C präzipitiert, bevor die Präzipitate mit Harnstoff (6 M, Invitrogen) + ThioHarnstoff (2 M, Sigma-Aldrich) lysiert und mit 10 mM DTT (40 Min.) reduziert wurden , Thermo Scientific) und mit 55 mM IAA (Thermo Scientific) im Dunkeln alkyliert (40 min). Anschließend wurden die Proben über Nacht mit 0,5 µg LysC/Trypsin (Thermo Scientific) verdaut und auf Empore C18 STAGE-Spitzen (Supelco) entsalzt.

Die Peptide wurden durch nanoskalige C18-Reverse-Chromatographie getrennt, die über eine Nanoelektrospray-Ionenquelle bei 2,15 kV online an ein Orbitrap Fusion Lumos Tribrid-Massenspektrometer oder Orbitrap Fusion Tribrid-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific) gekoppelt war. Puffer A bestand aus 0,1 % Ameisensäure und Puffer B aus 0,1 % Ameisensäure und 80 % Acetonitril. Für die markierungsfreie Analyse wurden die Peptide 17 Minuten lang mit 300 nl/min bei 5 % Puffer B geladen, 5 Minuten lang bei 5 % Puffer B äquilibriert (17–22 Minuten) und durch Erhöhen des Puffers B von 5 auf 27,5 % eluiert ( 22–122 Min.) und 27,5 bis 40 % (122–132 Min.), gefolgt von einer 5-minütigen Wäsche auf 95 % und einer 6-minütigen Regeneration auf 5 %. Übersichtsscans von Peptidvorläufern von 375 bis 1500 m/z wurden mit einer Auflösung von 120.000 (bei 200 m/z) mit einem 4 × 105-Ionenzählziel durchgeführt. Die Tandem-Massenspektrometrie wurde durch Isolation mit dem Quadrupol, mit Isolationsfenster 0,7, Fragmentierung durch Kollisionsdissoziation mit höherer Energie (HCD) mit normalisierter Kollisionsenergie von 30 und Rapid-Scan-Massenspektrometrieanalyse in der Ionenfalle durchgeführt. Das Ionenzählziel der Tandem-Massenspektrometrie (MS2) wurde auf 3 × 104 eingestellt und die maximale Injektionszeit betrug 20 ms. Für MS2 wurden nur die Vorläufer mit dem Ladungszustand 2–7 beprobt. Die dynamische Ausschlussdauer wurde auf 30 s mit einer Toleranz von 10 ppm um den ausgewählten Vorläufer und seine Isotope eingestellt. Die Auswahl der Monoisotopenvorläufer wurde aktiviert. Das Instrument wurde im Höchstgeschwindigkeitsmodus mit 3-s-Zyklen betrieben. Alle Daten wurden mit der Xcalibur-Software (Thermo Fisher Scientific) erfasst.

Für die Phosphoproteomics-Erfassung von SILAC-markierten Proben wurden tryptische Peptide 17 Minuten lang mit 300 nl/min bei 5 % Puffer B geladen, 5 Minuten lang bei 5 % Puffer B äquilibriert (17–22 Minuten) und durch Erhöhen von Puffer B von 5 auf eluiert 15 % (22–87 Min.) und 15 bis 38 % (87–147 Min.), gefolgt von einer 10-minütigen Wäsche auf 90 % und einer 5-minütigen Regeneration auf 5 %. Übersichtsscans von Peptidvorläufern von 350 bis 1750 m/z wurden mit einer Auflösung von 240 K (bei 200 m/z) mit einem 2 × 105-Ionenzählziel durchgeführt. Die Tandem-Massenspektrometrie wurde durch Isolierung mit dem Quadrupol mit Isolationsfenster 1,6, HCD-Fragmentierung mit normalisierter Kollisionsenergie von 30 und Rapid-Scan-Massenspektrometrieanalyse in der Orbitrap durchgeführt. Das MS2-Ionenzahlziel wurde auf 105 eingestellt und die maximale Injektionszeit betrug 60 ms. Für MS2 wurden nur die Vorläufer mit dem Ladungszustand 2–7 beprobt. Die dynamische Ausschlussdauer wurde auf 60 s mit einer Toleranz von 10 ppm um den ausgewählten Vorläufer und seine Isotope eingestellt. Die Auswahl der Monoisotopenvorläufer wurde aktiviert. Das Instrument wurde im Top-N-Modus betrieben. Für SILAC-Proteomproben wurde ein leicht angepasstes Protokoll verwendet: Peptide wurden 17 Minuten lang mit 300 nl/min bei 5 % Puffer B geladen, 5 Minuten lang bei 5 % Puffer B äquilibriert (17–22 Minuten) und durch Erhöhen von Puffer B eluiert 5 bis 28 % (22–80 Min.) und 28 bis 40 % (80–85 Min.), gefolgt von einer 5-minütigen Wäsche auf 95 % und einer 5-minütigen Regeneration auf 5 %. Der Vermessungsscan wurde auf 240 K mit einem 1 × 106-Ionenzählziel eingestellt. Die Tandem-Massenspektrometrie wurde an den 10 intensivsten Ionen durch Isolierung mit dem Quadrupol und Analyse in der Ionenfalle mit einer Auflösung von 30 K durchgeführt. Das MS2-Ionenzählziel wurde auf 5 × 104 mit einer maximalen Injektionszeit von 60 ms eingestellt. Das Instrument wurde im Höchstgeschwindigkeitsmodus mit 3-s-Zyklen betrieben. Alle Daten wurden mit der Xcalibur-Software erfasst.

Die RAW-Massenspektrometriedateien wurden mit der MaxQuant-Rechenplattform 1.6.2.10 verarbeitet. Proteine ​​und Peptide wurden mithilfe der Andromeda-Suchmaschine durch Abfrage der menschlichen Uniprot-Datenbank (Veröffentlichung 2019) identifiziert. Es wurden Standardeinstellungen mit den zusätzlichen Optionen Übereinstimmung zwischen Läufen, LFQ, IBAQ und eindeutigen Peptiden zur Quantifizierung ausgewählt. Für SILAC-Proben wurde die Multiplizität auf 3 gesetzt (für Arg0 und Lys0, Arg6 und Lys4 und Arg10 und Lys8) und die Option zur erneuten Quantifizierung wurde aktiviert, wo zutreffend, wurde Phospho STY als dynamische Modifikation eingestellt. Die Daten wurden mit R 3.5.2/RStudio 1.1.456 analysiert. Für markierungsfreie Daten wurden „umgekehrte“, „potenzielle Kontaminanten“ und „nur nach Standort identifizierte“ Peptide herausgefiltert. Proteine ​​und Phosphosite wurden auf mindestens 100 % gültige Werte pro Versuchsgruppe gefiltert. Die LFQ-Werte wurden in die log2-Skala umgewandelt. Fehlende Werte wurden durch eine Normalverteilung (Breite = 0,3, Verschiebung = 1,8) unterstellt, wobei davon ausgegangen wurde, dass diese Proteine ​​nahe an der Nachweisgrenze lagen. Batch-Effekte wurden für die Verwendung von ComBat im SVA-Paket korrigiert. Markierungsfreie statistische Analysen wurden mit LIMMA79 durchgeführt. Für die SILAC-Datenanalyse wurde eine statistische Analyse unter Verwendung eines linearen Modells durchgeführt, ohne nicht unterstellte Daten abzufangen. Zu Clustering-Zwecken wurden fehlende Werte durch lineare Näherung unter Verwendung des Amelia-Pakets imputiert. Sowohl für markierungsfreie als auch für SILAC-Daten wurden moderierte t-Tests verwendet, um unterschiedlich häufig vorkommende Proteine ​​zu bestimmen80. Ein BH-bereinigter p < 0,05 und eine log2-fache Änderung > 1 wurden als signifikant und relevant angesehen. Für markierungsfreie Sekretomics-Daten wurde ein BH-bereinigter p < 0,01 und eine log2-fache Änderung > 1 als Signifikanzschwelle verwendet.

Die Rezeptor- und Ligandendefinition erfolgte wie von Rieckmann et al.8 beschrieben. Kurz gesagt, zur Definition von Rezeptorproteinen wurden „extrazelluläre“ Schlüsselwörter oder „GPI-Anker“-Topologiedomänen basierend auf den Anmerkungen der Uniprot-Wissensdatenbank verwendet. STRING-DB-Wechselwirkungen mit bekannten interagierenden Proteinen (kombinierte Werte > 0,4) wurden ausgewählt und für Uniprot-Schlüsselwörter „sekretiert“ und „Signal“ oder GO:CC-Begriffe „extrazellulärer Raum“ und „extrazelluläre Region“ annotiert, um Rezeptorliganden zu definieren. Verbindungen zwischen Rezeptoren und Liganden wurden in Cytoscape 3.8.0 visualisiert.

RNA-, Protein- und Phosphosit-Antworten bei der TNFα + IFNγ-Stimulation wurden basierend auf einer kombinierten Bewertung der Pearson-Korrelation mit einzelnen TNFα- und IFNγ-Bedingungen und der Effektgröße durch Bestimmung der Flächen unter den Kurven mithilfe der Flussmittelpakete klassifiziert. Die ersten Dynamiken wurden entweder als S1-TNFα-Form (Korrelationskoeffizient > 0,7 mit TNFα und <0,7 mit IFNγ-Stimulation) oder als S1-TNFα-Form kategorisiert. S2-IFNγ-Form (Korrelationskoeffizient <0,7 mit TNFα und >0,7 mit IFNγ-Stimulation); S3-gemeinsame Form (Korrelationskoeffizient >0,7 mit TNFα und >0,7 mit IFNγ-Stimulation) oder S4-TNFα + IFNγ-Form (Korrelationskoeffizient <0,3 mit TNFα und <0,3 mit IFNγ-Stimulation). Die Effektgrößen wurden als E1-TNFα-Effekt kategorisiert (AUC-Verhältnisse TNFα + IFNγ-Stimulation/TNFα-Stimulation <2 und TNFα + IFNγ-Stimulation/IFNγ-Stimulation >2); E2-IFNγ-Effekt (AUC-Verhältnisse TNFα + IFNγ-Stimulation/TNFα-Stimulation >2 und TNFα + IFNγ-Stimulation/IFNγ-Stimulation <2) und E3-TNFα + IFNγ-Effekt (AUC-Verhältnisse TNFα + IFNγ-Stimulation/TNFα-Stimulation >2 und TNFα + IFNγ-Stimulation/IFNγ-Stimulation >2). Die Klassifizierungen wurden auf „gemeinsam“ gesetzt, wenn die S3-, aber nicht die E3-Kriterien erfüllt waren; TNFα-Klassifizierung: S1 oder S3 + E1; IFNγ-Klassifizierung: S2 oder S3 + E2; TNFα + IFNγ-Klassifizierung: Die Klassifizierungen S3 oder E3 wurden erfüllt. Wenn keine Form- oder Effektgrößengrenzwerte erfüllt wurden, wurde die Klassifizierung auf „nicht klassifiziert“ gesetzt.

Um eine Entzündungskarte zu erstellen, wurden alle Transkripte, Proteine ​​und Phosphosites, die bei der TNFα + IFNγ-Stimulation statisch signifikant waren, ausgewählt und zu Gennamen zusammengefasst. Basierend auf STRING-DB-Interaktionswerten >0,9 wurden Gennamen mit Kanten verbunden. Kanten zwischen Phosphosites, entsprechenden Proteinen und Transkripten wurden manuell an das Netzwerk angehängt. Dieses Netzwerk wurde in Cytoscape 3.8.0 visualisiert. Wir haben zunächst die „EdgeBetweenness“ mithilfe der Funktion „Netzwerk analysieren“ ermittelt und anschließend das „Edge-weighted Spring Embedded Layout“ zur Visualisierung des Netzwerks verwendet. Wir haben Interaktionszentren basierend auf der Nähe der Knoten, dem Gesamtregulierungsniveau und der biologischen Überlappung hervorgehoben.

Die Koexpressionsanalyse wurde unter Verwendung des WGCNA-Pakets81 unter Verwendung eines signierten Netzwerks und einer Soft Power von 4 durchgeführt, minClusterSize wurde auf 10 gesetzt. GO-Terminreicherungs- und Pathway-Analysen wurden unter Verwendung der Pakete ClusterPofiler27 und rWikiPathways82 durchgeführt, Anreicherungen mit einem BH-angepassten p-Wert < 0,05 wurden als signifikant angesehen. Für die vergleichenden EC-Analysen haben wir drei Studien mit verschiedenen primär kultivierten ECs ausgewählt. Um Datensätze zu vergleichen, wurden Batch-Effekte entfernt und mithilfe des Limma-Pakets79 normalisiert.

Es werden statistische Tests eingesetzt und die Signifikanzgrenzwerte werden pro Experiment im Abschnitt „Methoden“ angegeben. Zur Reproduzierbarkeit wurden ECs von 19 verschiedenen Spendern zufällig in verschiedenen Pools von drei Spendern kombiniert (Ergänzungstabelle 2). Alle Stimulationen wurden in mindestens drei biologischen Replikaten durchgeführt, wie in jedem Experiment angegeben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Massenspektrometrie-Proteomikdaten wurden über das PRIDE83-Partner-Repository mit der Datensatzkennung PXD036582 beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt. Die mRNA-Sequenzierungsdaten wurden im Gene Expression Omnibus84 des NCBI hinterlegt und sind über die GE-Serien-Zugangsnummer (GSE213111) zugänglich. Die für alle Abbildungen dieser Studie verwendeten Quelldaten finden Sie in den Zusatzdaten 1–5. Weitere Informationen können auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor eingeholt werden.

Eigenverfasste Skripte sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde von der Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research mit den Zuschüssen LSBR-1517 an MvdB und LSBR-1923 an AJH und MvdB unterstützt

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Arie J. Hoogendijk, Maartje van den Biggelaar.

Abteilung für Molekulare Hämatologie, Sanquin Research, Amsterdam, 1066 CX, Niederlande

Stijn A. Groten, Eva R. Smit, Esmée FJ Janssen, Bart L. van den Eshof, Floris PJ van Alphen, Carmen van der Zwaan, Alexander B. Meijer, Arie J. Hoogendijk und Maartje van den Biggelaar

Abteilung für Biomolekulare Massenspektrometrie und Proteomik, Utrechter Institut für Pharmazeutische Wissenschaften (UIPS), Universität Utrecht, Utrecht, 3584 CS, Niederlande

Alexander B. Meijer

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SAG führte Experimente durch, analysierte Daten und verfasste das Manuskript. ERS analysierte Daten. EFJJ und BLvdE führten Experimente durch. FPJvA und CvdZ führten eine massenspezifische Datenerfassung durch. ABM betreute die Forschung. AJH entwarf die Studie, führte Experimente durch, überwachte die Forschung, analysierte Daten und verfasste das Manuskript. MvdB konzipierte die Studie, überwachte die Forschung und verfasste das Manuskript. Alle Autoren haben die endgültige Fassung des Manuskripts gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Maartje van den Biggelaar.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Thomas Mohr und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Zhijuan Qiu und Anam Akhtar. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Groten, SA, Smit, ER, Janssen, EFJ et al. Multi-Omics-Darstellung von Zytokin-induzierten endothelialen Entzündungszuständen. Commun Biol 6, 525 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04897-w

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Eingegangen: 16. Dezember 2022

Angenommen: 02. Mai 2023

Veröffentlicht: 15. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04897-w

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