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Sep 25, 2023

Bewertung humoraler und zellulärer Immunantworten, die durch einen Cocktail aus rekombinanten Antigenen des Virus der Afrikanischen Schweinepest, fusioniert mit OprI, bei Hausschweinen induziert werden

Virologie-Journal

Virology Journal Band 20, Artikelnummer: 104 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Afrikanische Schweinepest (ASF) ist eine äußerst tödliche Krankheit bei Hausschweinen, die durch das ASP-Virus (ASFV) verursacht wird, für das derzeit kein kommerzieller Impfstoff verfügbar ist. Das Genom von ASFV kodiert für mehr als 150 Proteine, von denen einige in Subunit-Impfstoffen enthalten sind, aber nur einen begrenzten Schutz gegen die ASFV-Infektion induzieren.

Um die durch ASFV-Proteine ​​induzierten Immunantworten zu verstärken, exprimierten und reinigten wir drei Fusionsproteine, die jeweils aus dem bakteriellen Lipoprotein OprI, zwei verschiedenen ASFV-Proteinen/Epitopen und einem universellen CD4+-T-Zell-Epitop, nämlich OprI-p30-modifiziertem p54-TT, OprI- p72-Epitope-verkürztes pE248R-TT und OprI-verkürztes CD2v-verkürztes pEP153R-TT. Die immunstimulierende Aktivität dieser rekombinanten Proteine ​​wurde zunächst an dendritischen Zellen untersucht. Anschließend wurde die humorale und zelluläre Immunität, die durch diesen drei mit ISA206-Adjuvans (O-Ags-T-Formulierung) formulierten OprI-fusionierten Proteincocktail induziert wurde, bei Schweinen untersucht.

Die OprI-fusionierten Proteine ​​aktivierten dendritische Zellen mit erhöhter Sekretion proinflammatorischer Zytokine. Darüber hinaus löste die O-Ags-T-Formulierung nach Stimulation in vitro ein hohes Maß an Antigen-spezifischen IgG-Reaktionen und Interferon-γ-sezernierenden CD4+- und CD8+-T-Zellen aus. Wichtig ist, dass die Seren und mononukleären Zellen des peripheren Blutes von Schweinen, die mit der O-Ags-T-Formulierung geimpft wurden, die ASFV-Infektion in vitro um 82,8 % bzw. 92,6 % reduzierten.

Unsere Ergebnisse legen nahe, dass der mit ISA206-Adjuvans formulierte OprI-fusionierte Proteincocktail bei Schweinen robuste ASFV-spezifische humorale und zelluläre Immunantworten induziert. Unsere Studie liefert wertvolle Informationen für die Weiterentwicklung von Subunit-Impfstoffen gegen ASP.

Die Afrikanische Schweinepest (ASP) ist eine hoch ansteckende hämorrhagische und verheerende Schweineviruserkrankung, die weltweit schwere wirtschaftliche Verluste verursacht und gegen die es keinen wirksamen Impfstoff gibt [1]. Der Erreger der ASF, das ASF-Virus (ASFV), ist ein großes umhülltes DNA-Virus, das zur Gattung Asfivirus innerhalb der Familie der Asfarviridae gehört [2]. Das ASFV-Genom variiert in der Länge zwischen etwa 170 und 193 kbp und kodiert mehr als 150 offene Leserahmen [3]. Abhängig von der Sequenz des B646L-Gens (kodierend für das Kapsidprotein p72) wird ASFV derzeit in 24 verschiedene Genotypen eingeteilt [4]. ASP wurde erstmals in Kenia gemeldet und ist seit vielen Jahren in Afrika südlich der Sahara endemisch [5]. Im Jahr 2007 wurde es in Georgien eingeführt und hat sich seitdem in vielen Ländern Osteuropas verbreitet [6]. Im Jahr 2018 trat ASP in China auf und hat sich rasch in vielen Regionen des Landes und anderen asiatischen Ländern ausgebreitet [7]. Millionen von Schweinen wurden durch ASP getötet oder gekeult, um die Krankheit zu bekämpfen. Derzeit ist ASP in China immer noch weit verbreitet und stellt weiterhin eine ernsthafte Bedrohung für die Schweineindustrie dar [8]. Daher ist ein sicherer und wirksamer Impfstoff gegen ASP dringend erforderlich.

Für die Entwicklung von Impfstoffen gegen ASP wurden verschiedene Ansätze evaluiert [9]. Allerdings waren alle Versuche, sichere und wirksame Impfstoffe gegen ASP zu entwickeln, erfolglos [9]. Impfstoffe mit inaktivierten Viren bieten bisher keinen Schutz [10]. Es wurde gezeigt, dass abgeschwächte oder niedrig virulente ASFV-Stämme bei Schweinen schützende Immunantworten gegen virulente ASFV-Stämme hervorrufen [11,12,13,14], aber bei den geimpften Schweinen treten in der Regel unerwünschte Nebenwirkungen wie chronische Virämie auf [15]. Darüber hinaus wirft die Anwendung lebender attenuierter ASFV ernsthafte Sicherheitsbedenken auf. Im Gegensatz dazu bieten Impfstoffe gegen ASFV-Untereinheiten trotz der Induktion eines nur teilweisen Schutzes gegen die ASFV-Provokation eine sicherere Option [16]. Eine Kombination aus rekombinantem p30 und p54 oder einem chimären Protein p54/30 schützte die Tiere nach einer ASFV-Exposition vor einer schweren Erkrankung [17, 18]. Die Immunisierung von Schweinen mit rekombinantem CD2v induzierte die Produktion schützender Antikörper und schützte 2/3 der Tiere vor der ASFV-Exposition [19]. Kürzlich wurde gezeigt, dass pEP153R wichtig für den Schutz vor einer homologen ASFV-Infektion ist [20]. Interessanterweise produzierten Schweine, die mit einer Kombination aus rekombinantem p30, p72, p54 und p22 immunisiert wurden, neutralisierende Antikörper, zeigten jedoch nach der Belastung nur einen verzögerten Krankheitsausbruch [21]. Es gibt zunehmend Belege dafür, dass zelluläre Immunantworten auch eine Schlüsselrolle bei der Abwehr einer ASFV-Infektion spielen [22, 23]. Die Immunisierung mit einer ASFV-DNA-Expressionsbibliothek schützte 60 % der Schweine vor einer ASFV-Exposition durch Antigen-spezifische CD8+-T-Zellen [22], was die Existenz potenziell schützender Antigene aufzeigt. Insgesamt legen aktuelle Ansätze zur Untereinheitsimpfung nahe, wie wichtig die Auswahl geeigneter ASFV-Antigene und die Verbesserung der schützenden humoralen und zellulären Immunität sind.

Das wichtigste äußere Membran-Lipoprotein I (OprI) von Pseudomonas aeruginosa ist ein Ligand des Toll-like-Rezeptors (TLR)-2 [24]. Es ist in der Lage, dendritische Zellen (DCs) dazu zu veranlassen, in vivo proinflammatorische Zytokine abzusondern, was indirekt adaptive Immunantworten moduliert [25]. OprI fungiert als natürliches Adjuvans und löst bei Fusion mit OprI starke humorale und zytotoxische T-Zell-Reaktionen gegen Peptide/Proteine ​​aus [26]. Die Anwendung von OprI in Fusionsproteinen wurde auf die von B646L und G1340L des ASFV kodierten Antigene ausgeweitet, und das resultierende Protein war in der Lage, zytotoxische T-Lymphozyten zu induzieren [27, 28]. Verschiedene Immunfunktionen von OprI, einschließlich der Förderung von Th1/Th2-Antworten, werden auf die Aktivierung der TLR-2-Signalübertragung zurückgeführt [29]. Die immunmodulatorische Aktivität von OprI-Fusionen wurde auch bei der Entwicklung von Impfstoffen genutzt [30] und kürzlich wurde gezeigt, dass die Immunisierung von Mäusen mit OprI-fusionierten Antigenen die vertikale Übertragung von Neospora caninum und die postnatale Mortalität deutlich hemmt [31].

In dieser Studie untersuchten wir die humoralen und zellulären Immunantworten, die durch einen Cocktail aus rekombinanten ASFV-Antigenen, fusioniert mit OprI, induziert werden, und ihre Auswirkungen auf die ASFV-Infektion. Wir haben drei rekombinante OprI-Fusionsproteine ​​entworfen und jedes Protein enthält zwei verschiedene ASFV-Proteine/Epitope, fusioniert mit dem C-Terminus von OprI und dem N-Terminus eines universellen CD4+-T-Zell-Epitops. Die immunstimulierende Aktivität dieser rekombinanten Proteine ​​wurde unter Verwendung von aus dem Knochenmark der Maus stammenden dendritischen Zellen (BMDCs) bewertet. Anschließend wurden die humoralen und zellulären Immunantworten, die durch einen Cocktail dieser drei OprI-Fusionsproteine ​​ausgelöst wurden, bei Schweinen untersucht. Die Auswirkungen von Immunseren und mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) immunisierter Schweine auf die ASFV-Infektion wurden in vitro bestimmt, um vorläufige Beweise zu liefern, bevor mit den Belastungsexperimenten an Schweinen begonnen wurde. Wir glauben, dass unsere Arbeit zur Entwicklung eines neuartigen Subunit-Impfstoffs gegen ASP beitragen wird.

Primäre porcine Alveolarmakrophagen (PAMs) wurden von großen weißen Schweinen (10–20 kg) gesammelt, die negativ auf das Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus, das klassische Schweinepestvirus, das ASFV und das Pseudorabiesvirus waren. Die PAMs wurden in RPMI-1640-Medium (Thermo Fisher Scientific, MA, USA), das 15 % fötales Rinderserum (FBS, Thermo Fisher Scientific) enthielt, bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. ASFV China/Sichuan/2019-Stämme (CN/SC/19) wurden vom Regional Laboratory of African Swine Fever, Lanzhou Veterinary Research Institute (LVRI, Chinese Academy of Agricultural Sciences, China) bezogen. Der für den Neutralisationstest verwendete ASFV CN/SC/19-Stamm wurde in PAMs vermehrt und titriert.

Die Aminosäuresequenzen der Proteine/Epitope, die zum Aufbau von Fusionsproteinen verwendet wurden, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Aminosäuresequenz von P. aeruginosa OprI wurde von der GenBank-Zugangsnummer X13748.1 und alle ASFV-Proteine/Epitope vom ASFV-Isolat China/2018 abgeleitet /AnhuiXCGQ wurden aus der GenBank-Zugangsnummer MK128995.1 abgerufen. Alle ausgewählten, experimentell validierten p72-Epitope wurden aus der Immune Epitope Database (IEDB [www.iedb.org]) bezogen. Entweder extrazelluläre oder intrazelluläre Domänen von pE248R, CD2v und pEP153R wurden ausgewählt, um Fusionsproteine ​​nach Proteinmotivanalyse mit SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/) zu konstruieren. Wie in Abb. 1 gezeigt, wurden drei OprI-Fusionsproteine, darunter OprI-p30-modifiziertes p54-TT, OprI-p72-Epitope-△pE248R-TT und OprI-△CD2v-△pEP153R-TT, konstruiert und als OPMT, OPET bezeichnet und OCET („△“ steht für abgeschnitten). Parallel dazu wurden die p30-modifizierten p54- und p72-Epitope △pE248R und △CD2v-△pEP153R als Kontrollen konzipiert und als PM, PE und CE bezeichnet. Die Aminosäuresequenzen aller Fusionsproteine ​​wurden in Nukleotidsequenzen umgewandelt, die chemisch synthetisiert (GenScript, NanJing, China) und in NdeI-XhoI-Stellen des pET30a(+)-Expressionsvektors (Novagen, San Diego, CA, USA) kloniert wurden. trägt einen 6 × Histidin-Tag. Die Integrität und Genauigkeit der konstruierten Expressionsplasmide wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.

Schematische Darstellung von sechs Fusionsproteinen, bezeichnet als OPMT, OPET, OCET, PM, PE und CE. OprI, vollständige Sequenz des bakteriellen Lipoproteins I; p30, vollständige Sequenz von p30; p54-1 und p54-2 stellen jeweils (Met1-Thr29) und (Ser53-Leu184) von p54 dar; p72-E1, p72-E2, p72-E3 und p72-E4 stellen jeweils (Gln364-Pro395), (Ala518-Lys552), (Tyr179-Leu210) und (Leu242-Pro273) von p72 dar; △pE248R, pE248R (Met1-Lys198); △CD2v, CD2v (Asp17-Tyr206); △pEP153R, pEP153R (Asn49-Lys158); TT-P2, ein universelles CD4+-T-Zell-Epitop; dicke gelbe Linie, Linker 1 " (GGGGS)3"; dünne gelbe Linie, Linker 2 „PG“

Jedes Expressionsplasmid wurde in kompetente Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS-Zellen (Takara, Dalian, China) transformiert und die resultierenden positiven Stämme wurden mit 1 mM Isopropylthio-β-galactosid bei einer optischen Dichte (OD) von 0,6 bei 600 nm induziert zur Expression der Fusionsproteine. OPMT, OPET und OCET wurden wie zuvor beschrieben aus den bakteriellen Außenmembranen isoliert [32]. Kurz gesagt, die Bakterienpellets wurden in Tris-EDTA-Puffer (pH 8,0) mit 2,5 mg/ml Lysozym (Genscript) resuspendiert und 35 Minuten auf Eis inkubiert. Nach Zugabe eines gleichen Volumens Sarkosyl (2 %, w/v) wurde die Mischung ultraschallbehandelt und dann 2 Stunden lang bei 4 °C und 100.000 × g ultrazentrifugiert, um unlösliche Außenmembranpellets zu erhalten. Nach der Behandlung mit Chloroform/Methanol (2:1, v/v) zur Extraktion überschüssiger Lipide wurden die äußeren Membranen in 6 M Guanidinhydrochlorid solubilisiert und anschließend durch Ni-Affinitätschromatographie in Gegenwart von 8 M Harnstoff gereinigt. Im Gegensatz dazu wurden PM, PE und CE im gleichen chromatographischen Verfahren von den Einschlusskörpern ihrer induzierten Bakterien gereinigt. Alle eluierten rekombinanten Fusionsproteine ​​wurden durch Dialyse neu gefaltet. Endotoxin wurde dann durch Phasentrennung mit Triton X-114 entfernt. Der Endotoxingehalt in den gereinigten Proteinproben wurde mit einem ToxinSensor™ Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit (Genscript) bestimmt.

Ungefähr gleiche Mengen jedes rekombinanten Proteins wurden einer 12 %igen SDS-PAGE unterzogen. Das Gel wurde mit Coomassie-Blau gefärbt oder auf Polyvinylidendifluoridmembranen (Milipore, San Diego, CA, USA) übertragen. Die Membranen wurden in 5 % Magermilch für 2 Stunden bei Raumtemperatur (RT) blockiert, gefolgt von einer Inkubation mit monoklonalem Anti-Histidin-Antikörper (mAb) (1:5000-Verdünnung, Abcam, Cambridge, UK) oder Anti-ASFV-Schweineserum (1). :300-Verdünnung, China Institute of Veterinary Drug Control, Peking, China) über Nacht bei 4 °C. Nach fünfmaligem Waschen mit 0,05 % Tween-20 in PBS (PBST) wurden die Membranen mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG (1:5000-Verdünnung, Abcam) oder HRP-konjugiertem Ziegen-Anti-Schwein-IgG inkubiert (1:5000 Verdünnung, Abcam) für 1 Stunde bei RT. Nach dem Waschen mit PBST wurden die Blots mit einem verstärkten Chemilumineszenzreagens (Thermo Fisher Scientific) entwickelt.

Alle rekombinanten Fusionsproteine ​​wurden auf DC-Stimulation untersucht. BMDCs wurden wie zuvor beschrieben generiert (33). Die BMDCs wurden gesammelt und auf eine Dichte von 5 × 105 Zellen/ml eingestellt und in Gegenwart jedes Proteins (1 oder 5 µg/ml), Lipopolysaccharids (LPS, 0,1 µg/ml) oder Medium 24 Stunden lang weiter kultiviert. Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) und Interleukin-12p70 (IL-12p70) wurden in den Kulturüberständen mit kommerziellen ELISA-Kits (Neobioscience, ShenZhen, China) gemessen.

Zwei Gruppen von Antigenen, eine bestehend aus OPMT (150 μg/ml), OPET (150 μg/ml) und OCET (300 μg/ml) und die andere aus PM (150 μg/ml), PE (150 μg/ml) und CE (300 μg/ml) wurden jeweils mit einem gleichen Volumen Montanide ISA206 (ISA206, SEPPIC Inc., Paris, Frankreich) emulgiert, um Wasser-in-Öl-in-Wasser-Mischungen (W/O/W) zu bilden , nämlich O-Ags-T-Formulierung (OPMT + OPET + OCET + ISA206) ​​und Ags-Formulierung (PM + PE + CE + ISA206). Insgesamt 11 sechs Wochen alte, gesunde Nachzuchtschweine wurden von einem örtlichen Bauernhof bezogen und im Großtierforschungszentrum des LVRI in Gruppen gehalten. Die Tierpflegeprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des LVRI genehmigt. Alle Schweine wurden zufällig in drei Gruppen eingeteilt (n = 4 für Gruppe 1 und Gruppe 2, n = 3 für die Kontrollgruppe) und zweimal im Abstand von drei Wochen intramuskulär immunisiert. Tiere in Gruppe 1 und Gruppe 2 wurden mit der O-Ags-T-Formulierung bzw. der Ags-Formulierung (2 ml/Schwein) immunisiert. Kontrollschweinen wurde ein gleiches Volumen PBS, formuliert mit ISA206, verabreicht. Allen Schweinen wurde 0, 14, 21, 35 und 42 Tage nach der Impfung Blut entnommen (dpv).

Antigenspezifische IgG-Reaktionen in den Seren geimpfter Schweine wurden durch indirekten ELISA gemessen. Kurz gesagt, 96-Mikrotiterplatten (Costar, Cambridge, MA, USA) wurden mit rekombinantem p30 (0,125 µg/ml), modifiziertem p54 (0,5 µg/ml), p72 (1 µg/ml) und △pE248R (1) vorbeschichtet µg/ml), △CD2v (2 µg/ml) und △pEP153R (2 µg/ml) über Nacht bei 4 °C und blockiert mit 5 % Magermilch für 2 Stunden bei 37 °C. In jede Vertiefung wurden Serumproben (1:100-Verdünnungen) von immunisierten Schweinen gegeben und 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Parallel dazu wurden Blind- und Negativkontrollen angelegt. Nach fünf Wäschen mit PBST wurden die Platten 1 Stunde lang bei 37 °C mit Anti-Schwein-IgG-HRP (1:10.000-Verdünnungen) inkubiert. Nach einer letzten Waschreihe wurden die Farben mit 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin-Substrat 15 Minuten lang bei 37 °C entwickelt und mit 2 M H2SO4 gestoppt. Die OD bei 450 nm (OD450) jeder Vertiefung wurde mit einem Mikroplattenlesegerät (Thermo Fisher Scientific) bestimmt.

Von jedem immunisierten Schwein wurden periphere Blutproben bei 42 dpv in Natrium-Heparin-Vacutainer-Röhrchen gesammelt. PBMCs wurden aus heparinisiertem Blut unter Verwendung einer Lymphozyten-Trennlösung (Dakewei, Shenzhen, China) isoliert und mit 5(6)-Carboxyfluoresceindiacetat-Succinimidylester (CFSE, Invitrogen, San Diego, CA, USA) zum Nachweis der Zellproliferation angefärbt. Kurz gesagt: Insgesamt wurden 2 × 106 PBMCs mit 1 ml CFSE-Markierungslösung (1,25 µM) 10 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen in RPMI-1640 mit 5 % FBS bei 1 × 106 Zellen/ml resuspendiert und in 24-Well-Platten (1 × 106 Zellen/Well, Corning, NY, USA) in Gegenwart kultiviert von hitzeinaktiviertem ASFV (105 50 % hämaadsorbierende Dosen (HAD50)) für 72 Stunden. Parallel dazu wurden ungefärbte Zellen und gefärbte Zellen, die mit Concanavalin A (5 μg/ml, Dakewei) oder Medium behandelt wurden, als Leer-, Positiv- bzw. Negativkontrollen etabliert. Die Zellen wurden zur Proliferationsanalyse mittels Durchflusszytometrie gesammelt, was durch eine verminderte CFSE-Fluoreszenzintensität (CFSE-low) angezeigt wurde.

PBMCs wurden wie oben beschrieben erhalten und in Platten mit 24 Vertiefungen ausgesät (1 × 106 Zellen 1 ml/Vertiefung). Nach Zugabe von inaktiviertem ASFV (105 HAD50) zu jeder Vertiefung wurden die Zellen 40 Stunden lang kultiviert und dann weitere 8 Stunden mit Monensin (1,7 μg/ml, Biolegend, San Diego, CA, USA) inkubiert. Parallel dazu wurden mit einem Zellaktivierungscocktail (1:1000-Verdünnung, Biolegend) oder Medium inkubierte PBMCs als Positiv- und Negativkontrollen etabliert. Die Zellen jeder Vertiefung wurden gesammelt und 30 Minuten lang mit PerCP/Cyanin-Farbstoff 5,5-konjugierten Anti-CD3-, Fluoresceinisothiocyanat-konjugierten Anti-CD4- und Phycoerythrin-konjugierten Anti-CD8α-mAbs (alle von BD Biosciences, San Diego, USA) gefärbt bei 4 °C. Nach der Behandlung mit Fix- und Perm-Reagenzien (BD Biosciences) wurden die Zellen 30 Minuten lang mit Alexa Fluor 647 (AF647)-konjugiertem Anti-IFN-γ-mAb (BD Biosciences) gefärbt. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und einer Durchflusszytometrieanalyse unterzogen. Die Zellen wurden abgeschirmt, um CD3+-T-Lymphozyten auszuwählen, wobei das Tor für CD4+- und CD8+-T-Zellen weiter bestimmt wurde. Für jede Probe wurden die Prozentsätze der IFN-γ-produzierenden (IFN-γ+) CD4+- und CD8+-T-Zellen analysiert.

Die Neutralisierungsaktivität der Seren jeder Gruppe, die bei 0 (Präimmunseren) und 42 dpv (Immunseren) gesammelt wurden, wurde wie zuvor beschrieben bewertet [34]. ASFV CN/SC/19 (Infektionsmultiplizität (MOI) = 0,01, berechnet durch PAMs für die Inokulation) wurde mit 200 μl hitzeinaktivierten Seren (Verdünnung: 1/5) oder einem gleichen Volumen Medium (Negativkontrolle) gemischt und inkubiert über Nacht bei 37 °C. Die Seren/ASFV-Mischung wurde auf PAMs-Monoschichten in 24-Well-Platten geimpft. Nach einstündiger Virusadsorption bei 37 °C wurden die viralen Inokula entfernt und RPMI-1640 mit 5 % FBS hinzugefügt (500 μl/Vertiefung) und weitere 48 Stunden lang inkubiert. Für jede Probe wurden drei Replikate eingeschlossen. Die Kopienzahl des ASFV-Genoms in jeder Probe wurde mit quantitativen Polymerase-Kettenreaktions-Kits (qPCR) für ASFV (Diagnostic Products Center, LVRI) bestimmt. Der Prozentsatz der Neutralisierung für jede Serumprobe wurde wie folgt berechnet:

Neutralisierung (%) = 100 – 100 × Kopienzahl von ASFV in Gegenwart von Immunserum/Kopienzahl von ASFV in Gegenwart von Präimmunserum.

Die Neutralisierungsaktivität der Immunseren bei 42 dpv wurde auch durch indirekte Immunfluoreszenzanalyse bewertet. Die Seren wurden mit ASFV inkubiert und wie oben beschrieben auf PAMs-Monoschichten geimpft. Nach 48-stündiger Inkubation wurden die Zellen mit PBS gewaschen und 1 Stunde lang bei 4 ° C mit 4% Paraformaldehyd fixiert. Nach 10-minütiger Permeabilisierung mit 0,25 % Triton Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen 1 Stunde lang mit Tetraethylrhodaminisothiocyanat (TRITC) konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG (1:500-Verdünnungen, Abcam) inkubiert und anschließend 5 Minuten lang mit DAPI (Thermo Fisher Scientific) gefärbt. Nach drei Wäschen mit PBS erfolgte die Bildaufzeichnung mit einem Fluoreszenzmikroskop (Leica, Wetzlar, Deutschland).

PBMCs von immunisierten Schweinen mit 42 dpv wurden wie oben beschrieben erhalten und in 24-Well-Platten (500 μl/Well) bei 1 × 106 Zellen/ml kultiviert und 48 Stunden lang mit ASFV CN/SC/19 (MOI = 0,01) infiziert 37 °C. Als Kontrolle dienen PBMCs von nicht immunisierten gesunden Schweinen, die mit gleichen Mengen ASFV geimpft wurden. Für jede Probe wurden drei Wiederholungen durchgeführt. Die Kopienzahl des ASFV-Genoms in jeder Probe wurde mit qPCR-Kits für ASFV bestimmt und mit denen verglichen, die in PBMCs von nicht immunisierten Schweinen auftraten. Der Hemmungsprozentsatz der ASFV-Infektion für jede Gruppe von PBMCs wurde wie folgt berechnet:

Hemmung (%) = 100 – 100 × Kopienzahl von ASFV in PBMCs von immunisierten Schweinen/Kopienzahl von ASFV in PBMCs von nicht immunisierten Schweinen.

Alle Experimente wurden dreimal mit konsistenten Ergebnissen wiederholt. Die Daten in den Abbildungen werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt, wie in den Legenden der Abbildungen angegeben. Die statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen den Gruppen wurde durch eine Einweg-Varianzanalyse und Student-T-Tests (GraphPad Prism-Software, San Diego, CA, USA) bestimmt. Bei P > 0,05 wurde keine Signifikanz (NS) zwischen den Gruppen festgestellt. * P < 0,05, ** P < 0,01 und *** P < 0,001 wurden als statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen angesehen.

Der Expressionsvektor, der die für jedes Fusionsprotein kodierenden Gene enthält, wurde erfolgreich konstruiert und in E. coli zur Proteinexpression transformiert. Diese His-markierten rekombinanten Proteine ​​wurden durch Ni-Affinitätschromatographie gereinigt und durch SDS-PAGE verifiziert (Abb. 2A). Banden, die OPMT, OPET, OCET, PM, PE und CE entsprachen, waren nach der Färbung mit Coomassie-Blau deutlich sichtbar. Die gereinigten rekombinanten Proteine ​​wurden auch durch Western Blot unter Verwendung eines Anti-Histidin-mAb (Abb. 2B) und Anti-ASFV-Schweineserum (Abb. 2C) bestätigt. Nach der Endotoxinentfernung wurde die Endotoxinkonzentration in den gereinigten rekombinanten Proteinen durch Limulus-Amöbozyten-Lysat-Assays nachgewiesen und lag nachweislich unter 0,1 EU/µg.

Identifizierung gereinigter rekombinanter Fusionsproteine ​​durch SDS-PAGE und Western Blot. Eine SDS-PAGE-Analyse gereinigter rekombinanter Proteine. Spur M, Molekulargewichtsmarker; Spur 1, OPMT; Spur 2, OPET; Spur 3, OCET; Spur 4, PM; Spur 5, PE; Spur 6, CE. Western-Blot-Bestätigung gereinigter rekombinanter Proteine ​​mit Anti-Polyhistidin-mAb (B) oder Anti-ASFV-Schweineserum (C) als Primärantikörper und entsprechenden Sekundärantikörpern. Spurinhalte sind die gleichen wie in Panel (A)

Die immunstimulierende Aktivität der rekombinanten Proteine ​​wurde an BMDCs bewertet. Die Konzentrationen von TNF-α (Abb. 3A) und IL-12p70 (Abb. 3B) in den Kulturüberständen von BMDCs, die mit 1 μg/ml oder 5 μg/ml OPMT, OPET und OCET inkubiert wurden, waren signifikant höher als die von PM , PE und CE. Unter allen rekombinanten Proteinen induzierte OPMT bei beiden Konzentrationen die höchsten Konzentrationen an TNF-α und IL-12p70. Diese Ergebnisse legen nahe, dass OprI-fusionierte Proteine ​​in der Lage sind, eine starke und spezifische Stimulation von DCs zu induzieren.

Von DCs nach Stimulation sezernierte Zytokine. TNF-α (A)- und IL-12p70 (B)-Spiegel in Kulturüberständen nach Stimulation von BMDCs mit jedem rekombinanten Protein (1 oder 5 μg/ml), LPS (0,1 μg/ml) oder Medium (Kontrolle) für 24 Stunden. Alle Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3) angezeigt; NS = P > 0,05; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001

IgG-Reaktionen bei immunisierten Schweinen wurden durch indirekten ELISA gemessen. Wie in Abb. 4A–E gezeigt, waren die Konzentrationen von p30-, p54-, p72-, pE248R-, CD2v- und pEP153R-spezifischem IgG bei 14 dpv im Serum von Schweinen nachweisbar, die eine O-Ags-T-Formulierung erhielten oder Ags-Formulierung und stieg nach einer Auffrischungsimpfung auf ein höheres Niveau (bei 35 und 42 dpv). Im Gegensatz dazu waren alle sechs Arten antigenspezifischer IgGs in den Seren aller Schweine bei 0 dpv und von Schweinen, die zu jedem Zeitpunkt mit PBS immunisiert wurden, kaum nachweisbar. Im Vergleich zu Schweinen, die eine Ags-Formulierung erhielten, produzierten Schweine, die mit der O-Ags-T-Formulierung immunisiert wurden, ähnliche Mengen an p30- und p54-spezifischen IgGs, ohne signifikanten Unterschied zwischen ihnen zum gleichen Zeitpunkt (P > 0,05). Allerdings induzierte die Immunisierung von Schweinen mit der O-Ags-T-Formulierung im Vergleich zur Immunisierung mit der Ags-Formulierung signifikant höhere Konzentrationen an p72-, pE248R-, CD2v- und pEP153R-spezifischen IgGs bei 35 und 42 dpv. Zusammenfassend deuten die Daten darauf hin, dass die Immunisierung mit einem Cocktail aus OprI-Fusionsproteinen, die mit ISA206 formuliert wurden, bei Schweinen effizient ASFV-Antigen-spezifische IgG-Reaktionen hervorrief.

Antigenspezifischer IgG-Nachweis. IgG-Reaktionen auf p30 (A), p54 (B), p72 (C), pE248R (D), CD2v (E) und pEP153R (F) in den Seren jedes immunisierten Schweins bei 0, 14, 21, 35 und 42 dpv wurden durch indirekte ELISAs mit Serumverdünnungen von 1:100 und Ziegen-Anti-Schwein-IgG-HRP-Verdünnungen von 1:10.000 nachgewiesen. Die Ergebnisse werden als OD450 (Mittelwert ± SD) ausgedrückt. NS = P > 0,05; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001

Um zelluläre Immunantworten bei immunisierten Schweinen zu bestimmen, wurde die Proliferation von Lymphozyten in PBMCs jedes Schweins bei 42 dpv durch CFSE-Markierung bewertet. Wie in Abb. 5A gezeigt, wiesen Schweine, die eine O-Ags-T-Formulierung erhielten, den höchsten Prozentsatz an CFSE-niedrigen Lymphozyten unter drei Gruppen auf, wenn sie mit inaktiviertem ASFV stimuliert wurden, was auf die höchste Proliferation von Lymphozyten hinwies. Mit der Ags-Formulierung immunisierte Schweine zeigten nach der Stimulation eine mäßige Proliferation von Lymphozyten. Im Gegensatz dazu wurde in PBMCs von PBS-immunisierten Schweinen keine Proliferation von Lymphozyten festgestellt. Die Prozentsätze proliferativer Lymphozyten wurden in drei unabhängigen Experimenten bestimmt (Abb. 5B). Die Immunisierung von Schweinen mit der O-Ags-T-Formulierung induzierte einen signifikant höheren Prozentsatz der Lymphozytenproliferation als die Immunisierung mit der Ags-Formulierung oder PBS (P < 0,001).

Lymphozytenproliferation in PBMCs von immunisierten Schweinen nach In-vitro-Stimulation mit inaktiviertem ASFV. A Der Prozentsatz der CFSE-niedrigen Lymphozyten (dargestellt durch P2), der durch Durchflusszytometrie in PBMCs von immunisierten Schweinen bei 42 dpv nach Anfärbung mit CFSE und Inkubation mit inaktiviertem ASFV, Medium (Negativkontrolle) oder Concanavalin A (Positivkontrolle) nachgewiesen wurde. Gruppe 1 und Gruppe 2 stellen jeweils Schweine dar, die mit der O-Ags-T-Formulierung oder der Ags-Formulierung immunisiert wurden. B Berechnete Prozentsätze proliferativer Lymphozyten basierend auf CFSE-niedrigen Lymphozyten in PBMCs aus drei separaten Experimenten. Die Diagramme zeigen mittlere Ergebnisse mit Fehlerbalken, die die SD angeben; **P < 0,01; ***P < 0,001

Um die Arten reaktiver Lymphozyten weiter zu untersuchen, wurde der Prozentsatz an IFN-γ+ CD4+- und CD8+-T-Zellen in PBMCs von immunisierten Schweinen bei 42 dpv durch Durchflusszytometrie bestimmt. Die CD3+-, CD4+- und CD8+-T-Zellen wurden einzeln aktiviert (Zusatzdatei 1: Abb. S1). Nach der Stimulation mit inaktiviertem ASFV zeigten PBMCs aller mit der O-Ags-T-Formulierung immunisierten Schweine hohe Prozentsätze an IFN-γ+ CD4+- und IFN-γ+ CD8+ T-Zellen (Zusatzdateien 2 und 3: Abb. S2 und S3). Die Prozentsätze von IFN-γ+ CD4+ und IFN-γ+ CD8+ T-Zellen in jeder Gruppe wurden in drei unabhängigen Experimenten bestimmt (Abb. 6A und B). Der Anteil sowohl an IFN-γ+ CD4+ als auch an IFN-γ+ CD8+ T-Zellen von Schweinen, die eine O-Ags-T-Formulierung erhielten, war signifikant höher als in den anderen Gruppen, was auf robuste T-Zell-vermittelte Immunantworten hinweist. Der durchschnittliche Prozentsatz an IFN-γ+ CD8+ T-Zellen von Schweinen, die eine O-Ags-T-Formulierung erhielten, war etwa doppelt so hoch wie der von IFN-γ+ CD4+ T-Zellen, was auf stärkere ASFV-spezifische CD8+ T-Zell-Reaktionen hinweist. Diese Daten zeigen, dass die Immunisierung von Schweinen mit einem OprI-Fusionsprotein-Cocktail starke ASFV-spezifische zelluläre Immunantworten hervorrief, die zur Abwehr einer ASFV-Infektion beitragen können.

IFN-γ-produzierende T-Zellen in PBMCs von immunisierten Schweinen bei 42 dpv. Der Prozentsatz der IFN-γ-sekretierenden CD4+ T-Zellen (A) und IFN-γ-sekretierenden CD8+ T-Zellen (B) in PBMCs von immunisierten Schweinen bei 42 dpv nach In-vitro-Stimulation mit inaktiviertem ASFV, Medium (Negativkontrolle) oder einer Zelle Aktivierungscocktail (Positivkontrolle). Die Diagramme zeigen mittlere Ergebnisse mit Fehlerbalken, die die SD angeben. NS = P > 0,05; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001

Um die ASFV-neutralisierende Aktivität der Immunseren zu analysieren, wurde deren Wirkung auf die ASFV-Proliferation in PAM-Monoschichten bestimmt. Im ersten Ansatz wurde die Kopienzahl des ASFV-Genoms in jeder Probe durch qPCR bestimmt. Wie in Abb. 7A gezeigt, verringerten die Seren von Schweinen, die entweder mit der O-Ags-T-Formulierung oder der Ags-Formulierung immunisiert wurden, im Vergleich zur Kontrollgruppe die Kopienzahl des ASFV-Genoms signifikant (P < 0,001), was auf eine Hemmung der ASFV-Proliferation in PAMs hinweist. Im Gegensatz dazu zeigten die Seren von mit PBS immunisierten Schweinen und allen Schweinen vor der Immunisierung keine Fähigkeit, die Kopienzahl des ASFV-Genoms zu reduzieren. Basierend auf den Ergebnissen wurden die Prozentsätze des ASFV berechnet, die durch die Seren von Schweinen, die mit der O-Ags-T-Formulierung oder der Ags-Formulierung immunisiert wurden, neutralisiert wurden. Der durchschnittliche Prozentsatz des Virus, der durch die Seren von Schweinen, die eine O-Ags-T-Formulierung oder eine Ags-Formulierung erhielten, neutralisiert wurde, betrug 81,6 % bzw. 82,8 %, ohne signifikanten Unterschied zwischen ihnen (P > 0,05) (Abb. 7B).

Neutralisierung der ASFV-Infektion durch die Seren immunisierter Schweine bei 42 dpv. A Die Kopienzahl des ASFV-Genoms in mit ASFV infizierten PAMs (MOI = 0,01), vorinkubiert mit hitzeinaktivierten Präimmunseren, Immunseren (beide bei 1:5-Verdünnung) bzw. gleichem Mediumvolumen (Negativkontrolle). B Der Prozentsatz der ASFV-Neutralisierung durch die Seren von Schweinen, die mit O-Ags-T-Formulierung oder Ags-Formulierung bei 42 dpv immunisiert wurden. Die mittleren Ergebnisse mit Standardfehler werden angezeigt. NS = P > 0,05; ***P < 0,001

Die ASFV-neutralisierende Aktivität von Immunseren wurde auch anhand der verringerten Anwesenheit von ASFV in PAMs durch indirekte Immunfluoreszenz bestimmt. Im Gegensatz zu ASFV ohne Seruminkubation (negative Kontrolle) zeigte sich, dass die Inkubation von ASFV mit den Seren von Schweinen, die mit der O-Ags-T-Formulierung oder der Ags-Formulierung immunisiert waren, die TRITC-Intensität und die Anzahl der TRITC-positiven Zellen nach der Infektion deutlich reduzierte (Abb. 8). Im Gegensatz dazu gab es keine sichtbare Veränderung bei PAMs, die mit ASFV infiziert waren und mit PBS-immunisierten Seren vorinkubiert wurden. Diese Ergebnisse bestätigten, dass die durch die O-Ags-T-Formulierung oder die Ags-Formulierung bei Schweinen induzierten Antikörper in der Lage waren, die ASFV-Infektiosität in vitro zu neutralisieren.

Indirekte Immunfluoreszenz-Identifizierung von mit ASFV infizierten PAMs. Mit ASFV (MOI = 0,01) infizierte PAMs, die mit hitzeinaktivierten Immunseren (42 dpv) aus Gruppe 1 (O-Ags-T-Formulierung), Gruppe 2 (Ags-Formulierung) und PBS-Gruppe oder -Medium (Negativkontrolle) vorinkubiert wurden, wurden unterzogen indirekter Immunfluoreszenztest mit Anti-p30-mAb als Primärantikörper und Ziegen-Anti-Maus-IgG-TRITC als Sekundärantikörper. DAPI zeigt die Färbung des Zellkerns an. Das untere Feld stellt die Zusammenführung der beiden Kanäle oben dar

Aus immunisierten Schweinen bei 42 dpv isolierte PBMCs wurden mit ASFV infiziert, um ihre Auswirkungen auf die ASFV-Infektion zu untersuchen. PBMCs von nicht immunisierten oder PBS-immunisierten Schweinen zeigten beide nach der Infektion eine höhere ASFV-Genomkopienzahl, ohne signifikanten Unterschied zwischen ihnen (P > 0,05) (Abb. 9A). Im Gegensatz zu PBMCs von nicht immunisierten Schweinen nahm die Kopienzahl des ASFV-Genoms bei PBMCs von Schweinen, die mit O-Ags-T-Formulierung oder Ags-Formulierung immunisiert wurden, signifikant ab (P < 0,001), was auf deren hemmende Wirkung auf die ASFV-Infektion in vitro hinweist. Auf der Grundlage der obigen Ergebnisse wurde die prozentuale Hemmung der ASFV-Infektion bei PBMCs aus diesen beiden Gruppen berechnet und in Abb. 9B dargestellt. PBMCs von Schweinen, die mit der O-Ags-T-Formulierung immunisiert wurden, hemmten die ASFV-Infektion in vitro um bis zu 92,6 %, was deutlich höher war als bei Schweinen, die mit der Ags-Formulierung immunisiert wurden (p < 0,001). Dies deutet auf eine Verstärkung der antiviralen Wirkung zellulärer Immunantworten nach der Immunisierung von Schweinen mit dem OprI-fusionierten Proteincocktail hin.

Hemmung der ASFV-Infektion in PBMCs von immunisierten Schweinen bei 42 dpv. Eine Kopienzahl des ASFV-Genoms in PBMCs von nicht immunisierten Schweinen oder immunisierten Schweinen bei 42 dpv, die mit ASFV infiziert waren (MOI = 0,01). B ASFV-Hemmungsprozentsätze in PBMCs von Schweinen, die mit O-Ags-T-Formulierung oder Ags-Formulierung bei 42 dpv immunisiert wurden. Die mittleren Ergebnisse mit Standardfehler werden angezeigt. NS = P > 0,05; ***P < 0,001

Die Entwicklung sicherer und wirksamer Impfstoffe gegen ASP ist aufgrund der komplexen Natur des Virus eine große Herausforderung [8]. Unter den Ansätzen zur Entwicklung von ASFV-Impfstoffen scheinen lebende abgeschwächte ASFV-Stämme, die durch gezielte Gendeletion erzeugt werden, aufgrund ihrer Induktion einer robusten schützenden Immunität gegen die ASFV-Provokation sehr vielversprechend zu sein, dieser Ansatz birgt jedoch immer noch das Risiko einer Umkehrung zur Virulenz [35]. . Im Gegensatz dazu vermeiden auf Untereinheiten basierende Impfstoffe gegen ASFV diese potenziellen Probleme und scheinen einfacher herzustellen zu sein als abgeschwächtes ASFV [36]. Verschiedene Arten von auf Untereinheiten basierenden Impfstoffen gegen ASF wurden bei Schweinen mit ASFV-Infektion untersucht und einige von ihnen gewährten einen gewissen Schutz [17,18,19, 36], während einige von ihnen keinen Schutz boten, obwohl mehr ASFV vorhanden war Antigene waren in den Impfstoffen enthalten [21, 37]. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Auswahl geeigneter ASFV-Antigene und der Verbesserung der schützenden humoralen und zellulären Immunität bei der Entwicklung von Untereinheiten-Impfstoffen gegen ASF.

In der vorliegenden Studie wurden drei rekombinante Fusionsproteine ​​basierend auf p30, p54, p72, pE248R, CD2v und pEP153R konstruiert und zur Herstellung eines Cocktailimpfstoffs gegen ASP verwendet. Unter den ausgewählten ASFV-Proteinen wurden p30, p54, p72 und CD2v ausführlich in Subunit-Impfstoffen untersucht und es wurde gezeigt, dass sie schützende Immunantworten oder neutralisierende Antikörper gegen ASFV induzieren. Die anderen beiden ASFV-Proteine, pE248R und pEP153R, erwiesen sich in genetischen Knockout-Experimenten als potenzielle Schutzantigene [20, 38]. Aufgrund der Schwierigkeit bei der Expression von Membranproteinen und Proteinen über 100 kDa in E. coli [39] wurden alle Aminosäuresequenzen von Membranproteinen (p54, pE248R, CD2v, pEP153R) gemäß der Proteinmotivanalyse von SMART modifiziert oder verkürzt und die identifizierten p72-Epitope wurden anstelle der vollständigen Sequenz von p72 verwendet. Um die durch ASFV-Proteine ​​induzierten humoralen und zellulären Immunantworten zu verstärken, wurden OprI und das universelle CD4+-T-Zell-Epitop P2 (aa 830–844) des Tetanustoxoids (TT-P2) in die Konstruktion jedes rekombinanten Fusionsproteins einbezogen. Einerseits kann OprI, das auf TLR-2 abzielt, effizient von Monozyten/Makrophagen aufgenommen werden und antigenspezifische Immunantworten verbessern [26]. Andererseits wurde gezeigt, dass TT-P2 die Immunogenität eines Peptidimpfstoffs gegen Malaria [40] und eines Epitop-basierten Impfstoffs gegen Rotavirus [41] steigert. Der Hauptzweck unserer Studie besteht darin, die durch ASFV-Proteine ​​induzierten Immunantworten zu verstärken und das Impfpotenzial eines Cocktails aus drei OprI-fusionierten Proteinen weiter zu bewerten.

Da DCs professionelle Wächter im Immunsystem sind und für die Auslösung von Immunantworten von entscheidender Bedeutung sind (42), wurden murinen BMDCs verwendet, um die stimulierende Aktivität der rekombinanten Proteine ​​zu bewerten. Die OprI-fusionierten Proteine ​​waren in der Lage, DCs zu aktivieren, was durch die Sekretion höherer Mengen an TNF-α und IL-12p70 gezeigt wurde. Die durch OPMT und OPET induzierten TNF-α-Spiegel waren denen von OprI-Fusionsproteinen in einer früheren Studie ähnlich (31), während die durch OCET induzierten TNF-α-Spiegel relativ niedriger waren. Der wahrscheinlichste Grund dafür ist das Vorhandensein inhibitorischer Motive in CD2v oder pEP153R. Diese Schlussfolgerung wurde durch eine aktuelle Studie bestätigt, in der festgestellt wurde, dass pEP153R die Expression von MHC-Klasse I verringert [43]. Der Reifung und Aktivierung von DCs, die durch OprI-fusionierte Proteine ​​ausgelöst werden, wurde eine Aktivierung des TLR2/4-Signalwegs zugeschrieben [25]. Diese Ergebnisse legen nahe, dass OprI-fusionierte Proteine ​​in der Lage waren, DCs zu aktivieren und möglicherweise zur Aktivierung von T-Zell-vermittelten Immunantworten beitragen.

Die Daten aus dem ELISA zeigten, dass die Immunisierung mit der O-Ags-T-Formulierung oder der Ags-Formulierung bei Schweinen unterschiedliche Ausmaße an IgG-Reaktionen hervorrief. Beide Formulierungen induzierten bei Schweinen ähnlich hohe IgG-Spiegel gegen p30 und p54, was darauf schließen lässt, dass die Fusion von OprI und TT-P2 mit p30 und p54 nur geringe Auswirkungen auf die Immunogenität des Fusionsproteins hat. Dies ist höchstwahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass p30 und p54 von Natur aus stark immunogen sind [44]. Im Gegensatz dazu steigerte der Einschluss von OprI und TT-P2 die Immunogenität der Fusionsproteine ​​von p72-Epitopen und △pE248R sowie von △CD2v und △pEP153R erheblich (Abb. 4C-E). Dieser Befund legt nahe, dass die OprI-Fusionsstrategie zusammen mit TT-P2 die Immunogenität der Fusionsproteine, die aus weniger immunogenen ASFV-Proteinen bestehen, besser verbessern kann. Unsere Ergebnisse zeigen, dass robuste humorale Immunantworten durch einen Cocktail aus mit ISA206 formulierten OprI-Fusionsproteinen hervorgerufen werden, was unser Verständnis der Funktionen von OprI und TT-P2 bei Fusion mit viralen Proteinen vertieft.

Da gezeigt wurde, dass zelluläre Immunantworten einen großen Beitrag zur schützenden Immunität gegen intrazelluläre Infektionen mit ASFV leisten [22, 45, 46, 47], haben wir die Proliferation von Lymphozyten in PBMCs nach In-vitro-Stimulation bestimmt. Schweine, die mit der O-Ags-T-Formulierung immunisiert wurden, erzeugten ein deutlich höheres Maß an Lymphozytenproliferation als Schweine, die mit der Ags-Formulierung immunisiert wurden, was darauf hindeutet, dass die Fusion von OprI und TT-P2 mit Proteinen/Epitopen von ASFV die zellulären Immunantworten gegen ASFV deutlich verstärkte. Darüber hinaus wurden in unserer Studie auch IFN-γ+ CD4+ und IFN-γ+ CD8+ T-Zellen bestimmt, die funktionelle T-Lymphozyten darstellen. Entsprechend der Lymphozytenproliferation waren die Prozentsätze von IFN-γ+ CD4+- und IFN-γ+ CD8+ T-Zellen bei Schweinen, die mit der O-Ags-T-Formulierung immunisiert wurden, signifikant höher als die von Schweinen, die mit der Ags-Formulierung oder PBS immunisiert wurden. Von CD4+- und CD8+-T-Zellen sezerniertes IFN-γ trägt zur Polarisierung der Immunantworten in Richtung des Th1-Typs bei, und IFN-γ+-CD8+-T-Zellen können zytolytische Aktivität ausüben [48]. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Immunisierung mit einem OprI-fusionierten Proteincocktail die Aktivierung von ASFV-spezifischen T-Zellen begünstigt und zur Abwehr einer ASFV-Infektion beitragen kann.

Obwohl in den Seren von Schweinen, die mit der O-Ags-T-Formulierung geimpft wurden, höhere Mengen an antigenspezifischen IgGs nachgewiesen wurden, blieb unklar, ob die Immunseren in der Lage waren, das Virus zu neutralisieren. Daher wurden in vitro Neutralisationstests durchgeführt, um die ASFV-Neutralisierungsfähigkeit der Immunseren zu analysieren. Die Seren von Schweinen, die mit der O-Ags-T-Formulierung oder der Ags-Formulierung immunisiert wurden, neutralisierten in vitro mehr als 80 % des ASFV. In früheren Studien neutralisierte das Serum von Schweinen, die mit rekombinantem p30, exprimiert im Baculovirus, immunisiert wurden, etwa 90 % des ASFV, mehr als in unserer Studie [49]. Der wahrscheinlichste Grund für diese Diskrepanz könnte eine höhere Menge an Virusimpfung oder ein anderes in unserer Studie verwendetes Proteinexpressionssystem sein. Im Gegensatz dazu war der ASFV-Neutralisierungsprozentsatz der Seren von p54- oder p72-immunisierten Schweinen in derselben Studie relativ niedriger. In jüngerer Zeit zeigten die Seren von Schweinen, die eine Kombination aus rekombinanten ASFV-Proteinen und pcDNAs-exprimierenden ASFV-Genen erhielten, einen ähnlichen ASFV-Neutralisierungsprozentsatz wie unsere, trotz unterschiedlicher Tests, die im Neutralisierungstest verwendet wurden [50]. Obwohl Schweine, die mit der O-Ags-T-Formulierung immunisiert wurden, signifikant höhere Mengen an IgG gegen p72, pE248R, CD2v und pEP153R produzierten als Schweine, die mit der Ags-Formulierung immunisiert wurden, wurde das Virus interessanterweise durch die Seren von Schweinen, die beides erhielten, gleichermaßen gut neutralisiert ihnen. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass p30- und p54-spezifische IgGs eine dominante Rolle bei der Neutralisierung von ASFV spielen, ohne dass es einen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Gruppen gibt (Abb. 4A und 4B). Wir fanden auch heraus, dass ASFV durch die Seren von Schweinen, die mit einer der beiden Formulierungen immunisiert wurden, nicht vollständig neutralisiert wurde, wie in Abb. 7 dargestellt. Ähnliche Beobachtungen wurden in früheren Studien berichtet [51, 52], wahrscheinlich aufgrund der komplexen Natur von ASFV.

Um die Wirkung der zellulären Immunität auf die ASFV-Infektion zu untersuchen, wurde die Virusreproduktion in PBMCs immunisierter Schweine bestimmt. In Übereinstimmung mit den Prozentsätzen proliferativer Lymphozyten und IFN-γ+ CD8+ T-Zellen wurde gezeigt, dass PBMCs von Schweinen, die mit der O-Ags-T-Formulierung oder der Ags-Formulierung immunisiert wurden, die ASFV-Infektion in vitro im Vergleich zu PBMCs in den Kontrollgruppen signifikant hemmen. Ähnliche Beobachtungen wurden in einer früheren Studie berichtet, in der PBMCs von Makaken, die mit dem attenuierten Simian Immunodeficiency Virus (SIV) geimpft wurden, deutlich weniger empfindlich gegenüber einer In-vitro-Infektion mit virulentem SIV waren als PBMCs von naiven Kontrollen [53]. Die virushemmende Wirkung von PBMCs wurde virusspezifischen CD8+-T-Lymphozyten zugeschrieben [54]. Dementsprechend hemmten PBMCs von Schweinen, die mit der O-Ags-T-Formulierung immunisiert wurden und einen signifikant höheren Prozentsatz an IFN-γ+ CD8+ T-Zellen aufwiesen, einen fast zweifach höheren Prozentsatz der ASFV-Infektion in vitro als PBMCs von Schweinen, die mit der Ags-Formulierung immunisiert wurden. Diese Daten legen nahe, dass T-Lymphozyten, die durch Immunisierung mit einem Cocktail aus OprI-fusionierten Proteinen aktiviert werden, eine ASFV-Infektion in vitro besser hemmen können und zu wirksamen schützenden zellulären Immunantworten gegen die ASFV-Herausforderung führen können.

Die vorliegende Arbeit wurde als Erweiterung unserer früheren Arbeit durchgeführt und zeigte, dass OprI und TT-P2 in OPMT zur Verstärkung p30- und p54-spezifischer Immunantworten bei Mäusen beitragen und der durch OPMT induzierte Antikörper in vitro eine gewisse Neutralisierungsaktivität gegen ASFV zeigte [ 55]. Infolgedessen wurden OprI und TT-P2 zur Konstruktion von OPET und OCET verwendet, um die Immunogenität der p72-Epitope pE248R, CD2v und pEP153R zu verbessern, von denen gezeigt wurde, dass sie Anti-ASFV-Immunantworten induzieren [56]. Darüber hinaus wurden in der vorliegenden Studie humorale und zelluläre Immunantworten untersucht, die durch einen Cocktail aus OPMT, OPET und OCET bei Schweinen hervorgerufen wurden, sowie die ASFV-hemmenden Wirkungen der Immunseren und PBMCs. Die Ergebnisse dieser Studie bilden die Grundlage für ASFV-Challenge-Experimente mit der O-Ags-T-Formulierung.

Zusammenfassend zeigt unsere Arbeit, dass die Immunisierung mit einem Cocktail aus drei rekombinanten OprI-Fusionsproteinen, die jeweils zwei verschiedene ASFV-Proteine/Epitope, fusioniert mit dem bakteriellen Lipoprotein OprI und einem universellen CD4+-T-Zell-Epitop, formuliert mit ISA206-Adjuvans, starkes ASFV-spezifisches Humoral enthalten, induzierte und zelluläre Immunantworten bei Schweinen. Noch wichtiger ist, dass das Serum und die PBMCs der immunisierten Schweine in vitro 82,8 % bzw. 92,6 % der ASFV-Infektion hemmten, was wahrscheinlich mit einer wirksamen schützenden Immunität gegen ASFV-Exposition korreliert. Weitere Studien sollten darauf abzielen, die Schutzwirkung der O-Ags-T-Formulierung als Impfstoffkandidat gegen die tödliche ASFV-Infektion bei Schweinen zu bewerten, und es wird äußerst interessant sein, die Rolle verschiedener ASFV-Proteine ​​bei schützenden Immunantworten gegen ASFV zu untersuchen. Insgesamt liefert unsere Studie wertvolle Informationen für die Entwicklung zukünftiger Subunit-Impfstoffe gegen ASP.

Die in dieser Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze werden auf begründete Anfrage von den entsprechenden Autoren bezogen und sind dort erhältlich.

Afrikanische Schweinepest

Virus der Afrikanischen Schweinepest

Wichtiges Lipoprotein I der äußeren Membran

Tollartiger Rezeptor

Cluster der Differenzierung

Aus dem Knochenmark stammende dendritische Zellen

Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes

Schweine-Alveolarmakrophagen

Fetales Kälberserum

Lanzhou Veterinärforschungsinstitut

Ein universelles Tetanustoxoid CD4+ T-Zell-Epitop P2

Verkürztes CD2v-verkürztes pEP153R

p72-Epitope-verkürztes pE248R

p30-modifiziertes p54

OprI-verkürztes CD2v-verkürztes pEP153R-TT

OprI-p72-Epitope-verkürztes pE248R-TT

OprI-p30-modifiziertes p54-TT

Optische Dichte

Ethylendiamintetraessigsäure

Limulus-Amöbozyten-Lysat

Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Zimmertemperatur

Monoklonaler Antikörper

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

PBS mit 0,05 % Tween-20

Meerrettich-Peroxidase

Lipopolysaccharid

Tumornekrosefaktor-α

Interleukin-12p70

Interferon-γ

Ein Cocktail aus OPMT, OPET und OCET

Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Tage nach der Impfung

Immunglobulin G

5(6)-Carboxyfluoresceindiacetatsuccinimidylester

50 % hämaadsorbierende Dosen

Alexa Fluor 647

Quantitative Polymerase-Kettenreaktion

Tetraethylrhodaminisothiocyanat

Vielzahl von Infektionen

Standardabweichung

Keine Bedeutung

Großer Histokompatibilitätskomplex

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Wir danken Aixiu Wang für die Unterstützung beim Endotoxinnachweis, Lingxia Li und Ruoqing Mao für die Unterstützung bei der Durchflusszytometrieanalyse.

Diese Studie wurde durch Zuschüsse des National Key R&D Program of China (2021YFD1800034) unterstützt.

Staatliches Schlüssellabor für die Kontrolle und Prävention von Tierseuchen, OIE/China Nationales Referenzlabor für Maul- und Klauenseuche, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinesische Akademie der Agrarwissenschaften, Lanzhou, Provinz Gansu, China

Guanglei Zhang, Wei Liu, Sicheng Yang, Yunyun Ma, Guangqing Zhou, Xiaxia Liang, Chun Miao, Junhui Li, Yanhong Liu, Junjun Shao und Huiyun Chang

Institut für Tiergesundheit, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou, China

Shuai-Lied

Lanzhou Institute of Biological Products Co., Ltd. (LIBP), eine Tochtergesellschaft der China National Biotec Group Company Limited (CNBG), Lanzhou, 730046, China

Guanglei Zhang

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GZ, HC und JS konzipierten die Experimente; GZ, WL, SY, YM führten die Experimente durch; GZ, XL, CM, JL und YL analysierten die Daten; HC, JS und SS steuerten Reagenzien/Materialien/analytische Werkzeuge bei; GZ und HC haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Junjun Shao oder Huiyun Chang.

Alle Experimente mit ASFV wurden in einer Einrichtung der Biosicherheitsstufe 3 am Lanzhou Veterinary Research Institute (LVRI) der Chinesischen Akademie der Agrarwissenschaften (CAAS) durchgeführt. Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Vorschriften für die Verwaltung von Angelegenheiten in Bezug auf Versuchstiere durchgeführt, die von der Staatlichen Kommission für Wissenschaft und Technologie der Volksrepublik China und vom Ausschuss für Tierschutz und Tierschutz im LVRI des CAAS (Nr. LVRIAEC2018-008). Alle in dieser Studie verwendeten Tiere wurden während der Experimente artgerecht ausgeblutet und am Ende der Studie eingeschläfert.

Alle Autoren haben der Veröffentlichung des Manuskripts zugestimmt.

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

: Abb. S1. Die Gating-Strategie beim Nachweis von IFN-γ-produzierenden T-Zellen in PBMCs von immunisierten Schweinen bei 42 dpv.

: Abb. S2. Der Prozentsatz der IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Zellen (dargestellt durch P8) in PBMCs jedes immunisierten Schweins bei 42 dpv nach In-vitro-Stimulation mit inaktiviertem ASFV, Medium oder einem Zellaktivierungscocktail. Gruppe 1 und Gruppe 2 stellen jeweils Schweine dar, die mit der O-Ags-T-Formulierung oder der Ags-Formulierung immunisiert wurden.

: Abb. S3. Der Prozentsatz der IFN-γ-produzierenden CD8+ T-Zellen (dargestellt durch P5) in PBMCs jedes immunisierten Schweins bei 42 dpv nach In-vitro-Stimulation mit inaktiviertem ASFV, Medium oder einem Zellaktivierungscocktail. Gruppe 1 und Gruppe 2 stellen jeweils Schweine dar, die mit der O-Ags-T-Formulierung oder der Ags-Formulierung immunisiert wurden.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Zhang, G., Liu, W., Yang, S. et al. Bewertung humoraler und zellulärer Immunantworten, die durch einen Cocktail aus rekombinanten Antigenen des Virus der Afrikanischen Schweinepest, fusioniert mit OprI, bei Hausschweinen induziert werden. Virol J 20, 104 (2023). https://doi.org/10.1186/s12985-023-02070-7

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Eingegangen: 20. Dezember 2022

Angenommen: 14. Mai 2023

Veröffentlicht: 26. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-023-02070-7

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