Blog

Jul 10, 2023

Revolutionierung der Biopharma-Herstellung mit der vollautomatischen Droplet Digital™ PCR

Von der Entwicklung über die Qualitätskontrolle bis hin zur laufenden therapeutischen Bewertung, absolut

Von der Entwicklung über die Qualitätskontrolle bis hin zur laufenden therapeutischen Bewertung kann die absolute Quantifizierung von Nukleinsäuren der Schlüssel sein, um Ihr Biopharmaprodukt auf die nächste Stufe zu heben

Gesponserte Inhalte, die Ihnen bereitgestellt werden von

Zell- und Gentherapien entwickeln sich schnell zu vielversprechenden Ansätzen zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten, darunter Krebs, genetische Störungen und Autoimmunerkrankungen. Bei diesen Therapien wird häufig genetisches Material in die Zellen oder Gewebe eines Patienten übertragen, und sie erfordern eine präzise und genaue Messung von Nukleinsäuren, um beispielsweise Genexpression, Zellzahl und Virustiter zu bestimmen.

Um die Sicherheit und Wirksamkeit dieser Therapien zu gewährleisten, benötigen biopharmazeutische Hersteller zuverlässige Tools zur Überwachung und Analyse ihrer Produkte. Die digitale PCR (dPCR) hat sich zu einer leistungsstarken Technologie zur präzisen und genauen Quantifizierung von Nukleinsäuren in komplexen Gemischen entwickelt und ist damit ein unverzichtbares Werkzeug für die Herstellung von Zell- und Gentherapien. Da therapeutische Entwickler und Hersteller jedoch größtmögliche Sicherheit erreichen müssen, um sich auf ihre Produkte und Zulassungsanträge verlassen zu können, müssen sie bei der Auswahl eines dPCR-Systems und der Anwendung in ihrem Arbeitsablauf anspruchsvoll vorgehen.

Insgesamt übertrifft die digitale PCR-Technologie im Allgemeinen andere Ansätze zur Nukleinsäurequantifizierung wie die quantitative PCR (qPCR). Um die größtmögliche Präzision und Genauigkeit zu erreichen, müssen Experten jedoch zwischen den verschiedenen dPCR-Methoden und -Plattformen mit jeweils ihren Stärken und Einschränkungen unterscheiden.

Droplet Digital™ PCR (ddPCR™) erfreut sich immer größerer Beliebtheit, da es einige der Einschränkungen anderer dPCR-Methoden überwinden kann. Im Gegensatz zu anderen dPCR-Methoden, bei denen im Allgemeinen Chips, Platten oder Mikroarrays zur Aufteilung der Probe in einzelne Reaktionskammern verwendet werden, verwenden ddPCR-Assays eine Wasser-Öl-Emulsionstechnik, um die Probe in Tausende von Tröpfchen aufzuteilen. Diese Methode verringert das Risiko einer Kreuzkontamination und liefert präzisere und genauere Ergebnisse mit einem höheren Signal-Rausch-Verhältnis und einer geringeren Verstärkungsverzerrung.

Ein weiterer Vorteil der ddPCR-Technologie besteht darin, dass sie toleranter gegenüber Inhibitoren ist, die die PCR-Reaktion stören und zu falsch negativen Ergebnissen führen können. ddPCR-Assays reagieren auch weniger empfindlich auf Schwankungen der Reaktionsbedingungen, wie z. B. der Menge der zugeführten DNA oder RNA, die die Genauigkeit und Präzision anderer dPCR-Methoden beeinträchtigen können. Wenn diese Probleme zu minderwertigen Daten führen, müssen Biopharma-Wissenschaftler entweder das Experiment wiederholen – was Zeit und Reagenzien verschwendet – oder einen erfahrenen Benutzer beauftragen, Schwellenwerte manuell festzulegen und Ergebnisse zu interpretieren, was zu einem größeren Risiko menschlicher Fehler führt. Die Minimierung dieser Probleme mit der ddPCR-Technologie hilft Experten, sich auf ihre Ergebnisse verlassen zu können, was besonders für fortschrittliche Biopharmazeutika von entscheidender Bedeutung ist.

Präzise und genaue digitale PCR-Daten sind aufgrund der hohen Risiken bei der Entwicklung und Herstellung von Zell- und Gentherapien von entscheidender Bedeutung. Diese Therapien können möglicherweise lebensverändernde Behandlungen für Patienten ermöglichen, doch Fehler bei der Herstellung oder Dosierung könnten schwerwiegende Folgen haben. Ungenaue oder ungenaue Daten können zu einer suboptimalen Dosierung führen oder möglicherweise Patienten schädigen. Darüber hinaus erfordert die komplexe Natur dieser Therapien, die mehrere Zelltypen und genetische Veränderungen umfassen, eine genaue Quantifizierung der Zielnukleinsäuren. Die ddPCR-Technologie bietet ein leistungsstarkes Werkzeug zum Nachweis und zur Quantifizierung dieser Ziele in jedem Schritt der biopharmazeutischen Produktion.

Bestimmung des Virustiters

Adeno-assoziierte Viren (AAV) sind einer der am häufigsten verwendeten viralen Vektoren in der Gentherapie. Die genaue Quantifizierung des Virustiters ist für die Optimierung der Dosierung von AAV-basierten Therapien von entscheidender Bedeutung. Leider können herkömmliche Assays zur AAV-Titerbestimmung zeitaufwändig, arbeitsintensiv oder unzureichend empfindlich sein, wobei die Ergebnisse von mehreren Variablen beeinflusst werden. Umgekehrt kann die ddPCR-Technologie eine präzisere und genauere Quantifizierung von AAV-Genomen pro ml ermöglichen, was sie zu einem leistungsstarken Werkzeug zur Bestimmung des AAV-Titers macht.

Potenzquantifizierung

Die Anzahl der in einer Probe vorhandenen funktionellen Transgenkopien oder Viruspartikel bestimmt die Wirksamkeit von Zell- und Gentherapieprodukten. Die Wirksamkeit dieser Produkte ist von entscheidender Bedeutung, da sie die Wirksamkeit der Therapie und ihre allgemeine Sicherheit beeinflusst. Obwohl herkömmliche qPCR-basierte Methoden zur Potenzquantifizierung verwendet wurden, sind diese nicht immer genau und zuverlässig. Im Gegensatz dazu kann die ddPCR-Technologie eine absolute Quantifizierung der Anzahl der vorhandenen Zielsequenzen liefern, was zu präziseren und zuverlässigeren Wirksamkeitsbestimmungen führt.

Schadstofferkennung

Verunreinigungen kommen nur allzu häufig vor und können an jedem Punkt des Arbeitsablaufs in eine therapeutische Charge gelangen. Unabhängig davon, wo sie eindringen, können sie jedoch die Sicherheit und Wirksamkeit des Endprodukts ernsthaft gefährden. Insbesondere Mycoplasma-Bakterien sind eine häufige Kontamination in Zellkulturen, die aufgrund ihrer geringen Größe dem Nachweis durch herkömmliche mikroskopische Methoden entgehen kann. Darüber hinaus sind standardmäßige kulturbasierte Nachweistechniken mühsam, mangelhaft und es kann bis zu vier Wochen dauern, bis Ergebnisse vorliegen. Im Gegensatz dazu bietet die ddPCR-Technologie ein zuverlässiges Mittel zum Nachweis am selben Tag durch den Einsatz spezifischer Sonden, die auf die einzigartigen genetischen Signaturen von 112 Mykoplasmenarten abzielen können.

Eine weitere wichtige Kontamination, die bei der Herstellung von Zell- und Gentherapien überwacht werden muss, ist die DNA der Wirtszelle, insbesondere in Systemen, die die häufig verwendete Zelllinie HEK293 verwenden. Während HEK293-Zellen aufgrund ihrer Fähigkeit, hohe Mengen an rekombinanten Proteinen oder viralen Vektoren zu produzieren, weit verbreitet sind, bergen sie auch das Risiko einer DNA-Kontamination in Folgeprodukten. Hier kann die ddPCR-Technologie einen Vorteil gegenüber anderen PCR-Techniken bieten, da sie die DNA-Spiegel der Wirtszelle genau analysieren kann, um sicherzustellen, dass die Fragmentgröße und -menge innerhalb akzeptabler Grenzen liegt. Durch die Bereitstellung einer spezifischeren und präziseren Messung der Wirtszell-DNA kann ddPCR dazu beitragen, das Risiko von Immunreaktionen oder anderen unerwünschten Ereignissen bei Patienten, die das endgültige Gentherapieprodukt erhalten, zu minimieren.

Quantifizierung der Kopienanzahl

Zelltherapieprodukte wie chimäre Antigenrezeptor-T-Zellen (CAR) haben sich bei der Krebsbehandlung als vielversprechend erwiesen. Die Wirksamkeit dieser Therapien kann jedoch durch die Anzahl der in den Zellen vorhandenen Transgenkopien beeinträchtigt werden. Ohne Transgene trägt eine Zelle nicht zu einer wirksamen Behandlung bei, aber Zellen mit zu vielen Transgenen können sich nach der Injektion in einen Patienten abnormal verhalten. Herkömmliche qPCR-basierte Methoden zur Bestimmung der Kopienzahl sind für die Herstellung von Zelltherapien oft nicht präzise genug. Allerdings können ddPCR-Assays bestätigen, dass therapeutische Zellen Transgenzahlen enthalten, die innerhalb des von den Aufsichtsbehörden empfohlenen Bereichs liegen.

Das QX ONE™ Droplet Digital PCR (ddPCR)-System von Bio-Rad ist ein vollautomatisches ddPCR-System, das speziell auf die Bedürfnisse biopharmazeutischer Kunden zugeschnitten ist. Das QX ONE-System wurde unter anderem für die Verwendung bei der Bestimmung des AAV-Titers, der Wirksamkeitsquantifizierung, der Erkennung von Mykoplasmen und DNA-Kontaminanten in Wirtszellen sowie der Bestimmung der Kopienzahl in der Zelltherapie validiert.

Das System ist benutzerfreundlich und für den Walk-Away-Betrieb vollständig automatisiert, wodurch das Risiko menschlicher Fehler und Schwankungen verringert wird. Darüber hinaus machen die intuitive Software und der einfache Arbeitsablauf es einem breiten Benutzerspektrum zugänglich, von erfahrenen Molekularbiologen bis hin zu solchen mit wenig oder keiner PCR-Erfahrung.

Das QX ONE ddPCR-System ermöglicht fortschrittliches Multiplexing, das bis zu 480 Proben an einem einzigen Tag analysieren kann und so eine effiziente und kostengünstige Analyse ermöglicht. Darüber hinaus bietet das Unternehmen Software in regulatorischer Edition an, die Tools zur Unterstützung bei der Einhaltung gesetzlicher Anforderungen für Datenintegrität und Rückverfolgbarkeit enthält und sich somit für den Einsatz in einer GMP-Umgebung eignet. Zusammengenommen machen die Eigenschaften des QX ONE ddPCR-Systems es zu einem idealen Instrument für die Herstellung von Zell- und Gentherapien.

Entdecken Sie das QX ONE ddPCR-System und seine zahlreichen Anwendungen unter bio-rad.com/QXONE

Melden Sie sich an, um einen Kommentar zu hinterlassen

Diese Website verwendet Akismet, um Spam zu reduzieren. Erfahren Sie, wie Ihre Kommentardaten verarbeitet werden.